慢性乙型肝炎患者肝组织中HBV cccDNA定量检测与基因型的相关性分析

蔡伟雄 李惠平 何少雄 何伟彬

1.广东省博罗县人民医院检验科，广东博罗 516100；2.广东省博罗县人民医院感染科，广东博罗 516100

目前全世界受HBV感染者接近20亿，其中有超过3亿的慢性感染者。在亚太地区，慢性HBV感染率超过10%，其中25%～40%的患者会因合并或不合并肝细胞癌的肝硬化而死亡。世界卫生组织已将HBV感染列为全球十大死亡原因之一[1-3]。目前已建立对HBsAg、HBcAg及HBeAg及其抗体系统的检测法。三种抗原体系统中以检测HBsAg最为常用[4]。

为了进一步探明博罗地区慢性乙型肝炎感染者的基因型及其通过分子生物学来判断他们的病情轻重，笔者取患者的血清进行了基因型的检测及共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）的定量测定工作，并通过统计软件对二者的相关性进行统计学分析，以期为慢性乙型肝炎患者的诊断和治疗提供参考和帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

笔者对广东博罗地区2010年5月～2011年10月305例慢性乙型肝炎（CHB）患者行肝组织HBV cccDNA定量检测。通过数据分析，探讨患者肝组织中HBV cccDNA含量与患者的基因型的相关性，为临床诊断和治疗提供科学参考。所选患者当中，男242例，女63例；年龄15～54岁，平均（34.8±4.6）岁。以上患者院外半年内均未行接受任何形式的抗病毒治疗。将305例慢性乙型肝炎患者中随机分为4组，即：A组95例，B基因型69例占72.6%，疗程6个月，随访6个月；B组84例，B基因型62例占73.8%，疗程9～30个月，平均（17.5±4.1）个月；C组77例，B基因型51例占66.2%，疗程8个月，随访6个月；D组49例，B基因型38例占77.6%，疗程9～24个月，平均（16.9±4.7）个月。各组慢性乙型肝炎患者的基本资料见表1。统计分析表明，表中多个样本方差分析得4组的男女比例、年龄、HBV-DNA水平、基因型、基因亚型差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 检查与治疗方法

305例患者中，e抗原阳性的慢性乙型肝炎患者249病例，其中236例采用PCR-RFLP的方法测出基因型，另外13例扩增HBV S区直接测序，经Pubmed BLAST比对得出HBV基因型、基因亚型。在已确定基因型的基础上再进一步用PCR-RFLP法分基因亚型。249例慢性乙型肝炎患者中HBV B基因型172例占69.07%，C基因型77例占30.92%，未发现其他的基因型。B基因型中除一例没有测出亚型，余均为Ba亚型，未见Bj亚型；C基因型中一个为C1和C2的混合亚型，余均为C2亚型。

HBV-DNA基因分型检测也可以用ELISA法得以实现，主要是采用第一军医大学基础部生物医学诊断研究中心HBV基因分型微板核酸杂交试剂盒，对HBV2DNA定性检测阳性标本进行基因分型。（1）取处理液100μL于0.5 mL离心管内，加待测血清 100μL，混匀，100℃煮沸 15 min，12 000 r/min离心5 min，取上清液12μL于反应液管内，弹匀，10 000 r/min离心10 s，上机，预变性94℃ 2 min；循环条件：94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 65 s，共循环 38 次，最后 72℃延伸 3 min（阴性、阳性参照同标本处理）。（2）取扩增产物变性，98℃ 10 min，迅速冰浴10 min。各取杂交液90μL、已变性产物20μL、各型核酸探针25μL分别加入反应孔内，同时设空白对照（只加4滴杂交液及显色探针25μL），轻轻摇动混匀，50℃水浴60 min，轻轻倒净液体。（3）于每孔中加入杂交洗液200μL，50℃ 3～5 min，轻轻倒净再重复洗2次。（4）每孔加显色剂A、B各1滴，避光，置37℃ 10 min后加入终止液2滴，结果判定按P/N值（标本OD值/阴性参照OD值）＜3.0为阴性，P/N值≥3.0为阳性。常规肝穿刺取得肝组织，部分组织条放入高压灭菌EP管内，立即放入-70℃的冰箱内保存。采用ligh tcycler核酸扩增仪行肝组织HBV cccDNA及肝组织HBV-DNA和血清HBV-DNA定量测定。HBV cccDNA检测采用绍俊彬等设计的巢式PCR法。

1.3 统计学处理

采用SPSS18.0统计学软件进行数据分析，计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对t检验，计数资料采用x2检验，以α=0.05为作为检验的显著性水平,计量资料两指标间的相关性符合双变量正态分布，用直线相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1 不同组慢性乙型肝炎患者HBV基因型和HBV cccDNA含量检测结果相关性分析

对以上4组患者的HBV基因型和HBV cccDNA含量极性统计分析表明，二者差异无统计学意义（P＞0.05），即表明慢性乙型肝炎患的HBV基因型和HBV cccDNA含量的高低比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

乙型肝炎是病毒性肝炎中最常见，危害程度最大的一种。乙型肝炎病毒感染仍是威胁着人民健康的全球性问题。以放射免疫法及酶联免疫法及酶联免疫法最为敏感，其次为反向被动血凝及免疫粘附血凝法。免疫扩散与对流电泳法虽不甚敏感，但仍为我国广泛采用。研究表明，慢性乙型肝炎患者患者血清中出现cccDNA是肝脏损害的标志，可以反应病情的轻重及病情的进展，同时也反应了实时荧光定量PCR法检测CHB患者血清HBV cccDNA灵敏性较高、特异性强，可以应用于临床来监测乙型肝炎患者血清中cccDNA的水平及动态变化。HBV cccDNA含量是乙型肝炎病毒复制最特异的指标，其灵敏性和准确性都要超过目前常用的HBVDNA检测。

乙型肝炎病毒是一种DNA病毒，HBV的形态分3种[5]。第1种类似于大球形颗粒，也称Dane颗粒。Dane颗粒的中心部位就是环状并且有缺口的DNA双链，和依附在上面的DNA聚合酶。乙型肝炎病毒的基因组最引人注目的一个特征就是它非常小，其DNA分子大约含有约3 200个核苷酸，比已知的最大的病毒基因组小几百倍，和人类拥有的基因组相比较，仅仅是百万分之一。而且乙型肝炎病毒DNA的两链长短不一，长链完整，长度恒定，为负链。短链是正链，长度可变，大概是长链的50%～80%。表面抗原和核心抗原都是由Dane颗粒的DNA编码而来。

HBV基因组虽为双链环形DNA，但其复制过程有RNA逆转录病毒的特性，需要逆转录酶活性产生RNA/DNA中间体，再继续进行复制。其过程为：（1）在由病毒和（或）细胞来源的DNA-p作用下，正链首先延伸形成共价闭合环状DNA。（2）以此为模板，通过宿主肝细胞酶的作用转录成复制中间体。（3）再以此为模板，通过逆转录酶的作用，形成第一代和第二代DNA。此双链DNA部分环化，即完成HBV-DNA的复制。HBV突变株研究。由于HBV复制方式有其特殊性，即mRNA中间体进行逆转录过程中，由于缺乏校对酶（proofreading engymes）易发生HBV-DNA序列内变异。（1）S区基因突变导致HBsAg亚型改变及血清HBsAg阴性、HBV-DNA阳性乙型肝炎，使临床诊断困难。一些人接种乙型疫苗后产生抗-HBs，但仍可被HBV的S区基因突变株感染，而逃避宿主的免疫反应。（2）前C基因区突变与HBV感染后免疫及重型肝炎发病有关。一般认为乙型肝炎患者HBeAg转阴，抗-HBe转阳，表示HBV复制活跃程度减弱，临床症状好转。然而，一些患者当HBeAg转阴后，仍有病毒复制及病情进行性发展，其血清中除检出HBsAg和抗-HBe外，还可检出HBV-DNA、抗-HBcIgM，肝内HBcAg阳性，排除其他致肝损害的原因，提示病情变化与HBV有关。其特点为不易自然缓解，常发展为肝硬化，抗病毒治疗反应差。经研究表明，此类患者系感染了前C基因突变HBV突变株。（3）P区基因突变可致HBV复制减弱或停止。（4）X区基因突变可使HBxAg合成障碍。

现发现HBVA、B、C、D基因型可分为5种基因亚型，F基因型可细分为4种基因亚型，还有许多其他的基因亚型与重组型在不断发现中。大量的流行病学调查发现HBV基因型、基因亚型的分布具有明显地域性。我国乙型肝炎病毒主要以B、C基因型为主，另外有少量的A、D基因型分布，南方以B基因型多见，主要为Ba亚型；北方以C基因型多见，主要为C2亚型[6-8]。

乙型肝炎病毒具有高复制、高突变的特征，多年的自发突变导致形成多种基因型。本研究表明，慢性乙型肝炎患者HBV基因型和HBV cccDNA含量的高低差异无统计学意义（P＞0.05）。当全基因组核苷酸序列的差异超过8%时，被定义为一个基因型，应用该分型标准将HBV 分为A～H 8 种基因型。乙型肝炎病毒基因型间存在发病机制、疗效反应和预后的差异，对乙型肝炎病毒感染者HBV基因分型有助于流行病学分析、临床治疗和预后判断。

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