FISH技术探讨hTERC基因与子宫颈上皮内瘤样病变和宫颈癌的相关性

陈柯霖，王雅杰，康熙雄＊，冯力民

（首都医科大学附属北京天坛医院1.检验科；2.妇产科，北京 100050）

FISH技术探讨hTERC基因与子宫颈上皮内瘤样病变和宫颈癌的相关性

陈柯霖1，王雅杰1，康熙雄1＊，冯力民2

（首都医科大学附属北京天坛医院1.检验科；2.妇产科，北京 100050）

目的 应用荧光原位杂交技术检测研究子宫颈上皮内瘤样病变（CIN）和宫颈癌人类染色体末端酶（hTERC）基因表达情况。方法收集120例LCT标本，应用荧光原位杂交技术检测hTERC基因扩增情况。结果hTERC基因异常扩增阳性率在正常对照组与CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌组间有显著性差异（P＜0.01），在宫颈癌与CINⅠ、CINⅡ间有显著性差异（P＜0.05），随着宫颈病变级别增加，hTERC基因异常扩增的阳性率明显增加。结论hTERC基因异常扩增与宫颈癌密切相关；在LCT检查和HPV检测筛查宫颈癌的同时，检测hTERC基因扩增，有助于宫颈癌及癌前病变诊断，是预测癌前病变是否向宫颈癌进展的重要指标。

荧光原位杂交；染色体末端酶；宫颈上皮内瘤变；宫颈癌

（ChinJLabDiagn，2012，16：1199）

本实验旨在用荧光原位杂交（FISH）技术检测探讨人类染色体末端酶（hTERC）基因与宫颈上皮内瘤样病变和宫颈癌的相关性。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2007年5月至9月北京天坛医院妇科门诊就诊的20名患者的正常宫颈脱落细胞标本，编号分装，4℃保存，用于阈值的建立。

收集2007年10月至2009年2月北京天坛医院、北京友谊医院、北京海淀医院妇科门诊就诊的100名患者的宫颈脱落细胞标本，4℃保存，包括18例正常或炎症，36例CINⅠ，25例CINⅡ，12例CINⅢ和9例宫颈癌。患者年龄20－93岁。

纳入标准：按照宫颈上皮内瘤样病变诊断处理规范，分组标准依据病理诊断分为CINⅠ、Ⅱ、Ⅲ级，宫颈癌诊断按照《妇产科学》第六版诊断标准。

1.2 仪器与试剂FISH探针由北京金菩嘉医疗科技有限公司提供，为TERC／CSP3DNA探针，BX51型荧光显微镜由OLYMPUS提供，在DAPI／FIFC／Texas Red三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号。

1.3 方法

1.3.1 细胞标本采集 妇科门诊所收集的LCT标本。

1.3.2 利用FISH技术检测宫颈脱落细胞中hTERC基因的表达

①涂片制备 收集细胞保存液中的上皮细胞。加5ml去离子水37℃水浴30min，再离心，去上清，加5ml新鲜配置固定液（甲醇：冰醋酸＝3∶1）静置10min，离心，去上清，加2ml固定液滴片。呈单层细胞或少量成堆细胞。室温或冷藏保存。

②涂片预处理 涂片置于2×SSC溶液中漂洗5min，0.1MHCL溶液中浸泡10min，再置于2×SSC溶液中漂洗5min，将已经预热的40ml 0.01 M HCL倒入装有胃蛋白酶储存液的考普林瓶中混匀，将涂片置于37℃胃蛋白酶溶液中10min，之后再次置于2×SSC溶液漂洗5min，依次置于－20℃预冷的70%、85% 和100%乙醇各3分钟梯度脱水固定，自然干燥后置于56℃烤片机上进行预热。

③FISH操作步骤 避光环境中，配置探针混合液10μl，与预热的玻片放入70% 的甲酰胺／2×SSC变性液中，温度（7 3±1）℃ 变性5min，将玻片依次置于一20℃预冷的70%、85%和100%乙醇各3分钟梯度脱水，自然干燥，与变性后的探针杂交，立即加盖盖玻片，置于温箱的湿盒中过夜。

④涂片洗涤 移去盖玻片，立即将玻片置于46℃50%甲酰胺／2×SSC溶液中洗两次，每次5 min，46℃2×SSC溶液中漂洗10min，46℃0.1%NP-40／2×SSC溶液中洗涤5min，在室温下置于70%乙醇3min，暗处自然干燥，加15μl DAPⅠ复染剂于杂交区域，盖上盖玻片，30min后进行读片。

⑤FISH信号的判断 TERC DNA探针杂交到3号染色体3q26.3，荧光信号为红色，CSP3DNA杂交到3号染色体着丝粒，荧光信号为绿色，正常细胞信号为2红2绿，TERC基因扩增异常细胞信号为绿色不少于2个，红色大于2个。

2 结果

2.1 阈值的建立

取20例正常细胞学涂片，分别计数100个细胞，记录hTERC基因超过2个杂交信号的细胞数，阈值＝平均数＋3×标准差（SD），超过阈值为hTERC基因扩增阳性。本研究的阈值标准为8个异常细胞（8%）。

2.2 组织学分组中hTERC基因的表达情况

正常或炎症者hTERC基因异常扩增阳性率为5.6%（1／18例），CINⅠ患者为11.1%（4／36例），CINⅡ患者为60.0%（15／25例），CINⅢ患者为83.3%（10／12例），宫颈癌患者为100%（9／9例），随着宫颈病变级别增加，hTERC基因异常扩增的阳性率明显增加。

经统计学分析，hTERC基因异常扩增阳性率在正常对照组与CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌组间有显著性差异（P＜0.01），在宫颈癌与CINⅠ、CINⅡ间有显著性差异（P＜0.05），正常及CINⅠ者hTERC基因异常扩增阳性率显著低于CINⅡ及CINⅡ以上者（P＜0.01）（表1）。

表1 hTERC基因在正常组与CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、宫颈癌组中的表达

2.3 敏感度及特异度

hTERC基因扩增阳性诊断CINⅡ和CINⅡ以上病变的敏感度为73.9%，特异度为90.7%，阳性预测值为87.2%，阴性预测值为80.3%。

2.4 杂交信号分析

正常细胞中hTERC：CSP3为2：2，即2红2绿，CIN组hTERC基因的异常红色信号主要表现为3个或4个，而子宫颈癌中会出现5个甚至6个。见如图2所示。

图2 杂交信号分析

3 讨论

最近几年，大量针对宫颈癌的研究表明，宫颈细胞由非典型性发育异常向宫颈癌转变的过程中几乎都伴有3号染色体长臂扩增，并且异常基因区多位于3q26.1-3q28，最小3q扩增区域为3q26-3q27［5］。同时发现CIN特别是CINⅡ／Ⅲ患者3q异常扩增［6］，因此推测此区域可能存在宫颈癌发生的致病基因［7，8］。而 hTERC 基因正定位于该区域，提示hTERC基因是与宫颈癌相关的一个重要基因。

2003年和2005年 Heselmeyer.Haddad等［9］分别对子宫颈细胞涂片采用FISH三色探针均成功地进行hTERC基因检测，发现CIN I中hTERC基因的扩增阳性率占7.1%，而C1N Ⅱ和CINⅢ占62.5%和76.4%，宫颈癌组中所有的细胞都出现hTERC基因的扩增。本实验中，CIN I中TERC基因的扩增者只占11.1%，而C1NⅡ和CINⅢ占60%和83.3%，宫颈癌组为100%，与上述国外报道趋势一致。并且本实验中hTERC基因阳性率在正常对照组与CINⅡ、正常对照组与CINⅢ、正常对照与宫颈癌组间有显著性差异，进一步证实了hTERC基因与宫颈癌前病变和宫颈癌的相关性；在宫颈癌与CINⅠ、宫颈癌与CINⅡ间有显著性差异，表明了hTERC基因的表达对CIN发展到宫颈癌的预测意义。

［1］彭玉池，周 颖.HER-2、hTERC在子宫颈上皮脱落细胞的表达及临床意义［J］.中国妇幼保健，2008，23：4744.

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［3］吴家璐，李龙芸.荧光原位杂交技术对胸腔积液间期细胞染色体数同异常的研究［J］.癌症进展，2005，3（2）：467.

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［7］Kersemaekers AM，van de Vijver MJ，Kenter GG，et al.Genetic alterations during the progression of squamous cell carcinomas of the uterine cervix［J］.Genes Chromosomes Cancer，1999，26（4）：346.

［8］Heselmeyer K，Schr6ck E，du Manoir S.Gain of chromosome 3q defines tlle transition from severe dysplasia to invasive carcinoma of the uterine cervix［J］.Proc Natl Acad Sci，1996，93：479.

［9］Heselmeyer-Haddad K，Sommerfeld K M.White N.Genomicamplification of the human telomerase gene（TERC）in pap smeal＇s predicts the development of cervical cancer［J］.Am J Pathol，2005，166（4）：1229.

Study of relationship between hTERC gene and cervical intra-epithelial neoplasia，cervical cancer by FISH technique

CHENKe-lin，WANGYa-jie，KANGXi-xiong，etal.（BeijingTiantanHospitalAffiliatedtoCapitalMedicalU-niversity，Beijing100050，China）

ObjectiveApplication of FISH detection methods，reserch hTERC gene expression in cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer.Methods120cervical exfoliated cell specimens were selected，In order to detect hTERC gene amplification situation in these specimens by FISH technique.Resultsby statistical analysis，in this five group（normal and CINⅡ、normal and CINⅢ、normal and cervical cancer、CINⅠand cervical cancer、CINⅡand cervical cancer），the positive rates of hTERC gene amplification was significantly different.with cervical lesions level increased，the positive rate of hTERC gene amplification increased significantly.ConclusionhTERC gene amplification is closely related with cervical cancer；at LCT and HPV for cervical cancer detection，the detection of hTERC gene amplification，contribute to diagnose cervical cancer and precancerous lesion and predict Whether or not progress to cervical cancer.

Fluorescent in situ hybridization；Telomerase；Cervical intraepithelial neoplasia；Cervical cancer

R737.33

A

1007－4287（2012）07－1199－03

＊通讯作者

2011－01－24）