NGF及其受体TrkA和p75在发情周期内Wistar大鼠卵巢内的表达

王晓明，白 石，丁 军

（1.台州学院医学院 解剖与组织胚胎学教研室，浙江 台州 318000；2.吉林大学中日联谊医院 放射科，吉林 长春 130033）

NGF及其受体TrkA和p75在发情周期内Wistar大鼠卵巢内的表达

王晓明1，白 石1，丁 军2＊

（1.台州学院医学院 解剖与组织胚胎学教研室，浙江 台州 318000；2.吉林大学中日联谊医院 放射科，吉林 长春 130033）

目的 检测NGF及其受体TrkA和p75在发情周期内Wistar大鼠卵巢内的表达。方法利用免疫组织化学染色技术检测NGF及其受体TrkA和p75在卵巢内的细胞定位及蛋白表达情况；利用原位杂交方法检测在发情周期内大鼠卵巢NGF及其受体TrkA和p75的mRNA表达情况；利用Western blot技术检测发情周期内大鼠卵巢NGF及其受体TrkA和p75的蛋白表达情况。结果免疫组织化学染色结果显示发情周期内大鼠卵巢内NGF及其受体的表达，在各级卵泡的卵泡细胞、卵母细胞以及黄体内均有不同水平的表达；同时间点的原位杂交检测结果与免疫组织化学染色结果相一致；Western blot检测结果显示整个发情周期内卵巢内的NGF及其受体TrkA和p75的蛋白表达没有明显的波动。结论NGF及其受体TrkA和p75可促进发情周期内Wistar大鼠卵巢卵泡的卵泡细胞及卵母细胞的发育。

卵巢；NGF；TrkA；p75；卵泡

（ChinJLabDiagn，2012，16：0040）

神经生长因子（Nerve growth factor，NGF）是神经营养因子（neurotrophin，NTs）家族中的一员，是中枢神经系统和周围神经系统内神经细胞存活和分化所必需的靶源性营养因子［1］。NGF常通过激活其特异性受体，酪氨酸激酶受体A（tyrosine kinase A，TrkA）和p75，主要是通过激活TrkA来调控神经细胞的存活和分化。NGF与TrkA结合激活了一系列的胞内信号通路，如ERK和AKT途径，来促进神经细胞的存活和分化［2］。而p75可与活化的TrkA结合来强化NGF的作用。在没有TrkA的情况，活化的p75将诱导细胞凋亡［3］。但NGF及其受体，TrkA和p75并非只在神经系统内表达，亦可表达在免疫系统和内分泌系统内［2－5］。已有报道在多种雌性哺乳类动物的卵巢细胞内均有NGF和（或）TrkA，p75表达，如在成年女性［6－8］，雌性大鼠［9，10］、金黄地鼠［11］、牛［12，13］、绵羊［14，15］以及芝山羊［16］卵巢内均有表达。NGF及其受体可能是通过自分泌和旁分泌方式调节卵巢的诸多功能，如性成熟［17］，卵泡发育和 排卵［18，19］。但 NGF 及 其受体TrkA和p75在发情周期内雌性Wistar大鼠卵巢细胞内的周期性变化还未见报道。

1 材料方法

1.1 动物

雌性成年 Wistar大鼠，30只，雄性成年 Wistar大鼠5只，购自杭州师范大学动物中心，1月龄，体重90－110g，按性别分开饲养。

1.2 发情期的判定

大鼠安静饲养，普通饲料及饮水。通过两种方法判定发情期：定期检测晨起（8点）大鼠阴道涂片，监测阴道脱落上皮发育情况。当有较多的有核上皮细胞出现，死亡角化上皮细胞较少，且无白细胞出现时，提示此期大鼠处于发情前期［20，21］；通过发情期行为判定，发情期大鼠，活跃不安，多动；当将雄性大鼠放入雌性大鼠笼后，雄性大鼠有追尾、嗅尿，主动骑跨现象。两种方法均阳性时，判定为大鼠发情周期的第0天0小时。

1.3 取材

大鼠的发情周期一般为4－5天，较规律。实验分别于发情周期的5个时间点取材，即8h（排卵期），24h，32h，70h，80h（或0时），每个时间点取材6只。脱颈处死大鼠，取双侧卵巢备用。一侧卵巢，4%多聚甲醛固定，常规石蜡切片，片厚3－5 μm，用于免疫组织化学染色及原位杂交染色，另一侧卵巢用于Western blot检测。

1.4 免疫组织化学染色

一抗为兔抗大鼠NGF、兔抗大鼠TrkA和兔抗大鼠p75单克隆抗体，稀释度为1∶200；SABC免疫组织化学染色试剂盒，均为北京中杉生物试剂有限公司产品。按试剂盒说明书操作。光学显微镜观察染色强度，结果用＋，－号表示（强阳性：＋＋＋，阳性：＋＋，弱阳＋，阴性：－）。实验设阴性对照，对照切片操作过程同上，但不加特异性一抗，一抗用PBS代替。

1.5 mRNA原位杂交

NGF、TrkA和p75三种因子的mRNA原位杂交检测试剂盒（POD），均购自武汉博士德生物试剂有限公司。原位杂交程序均按试剂盒说明操作，以大鼠脊髓背根神经节为阳性对照，以PBS代替杂交液作阴性对照。

1.6 Western blot

取卵巢放入玻璃匀浆器中匀浆，取匀超声粉碎组织细胞，离心12 000rpm 3－5min，吸取上清备用。上清用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定（购自索莱宝生物科技有限公司，上海）蛋白质总量，操作步骤按说明书进行。各时间点均取等量的蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳，凝胶转膜，转移至硝酸纤维素膜。取该膜行免疫印迹染色，检测NGF及其受体TrkA和p75的蛋白表达水平。抗体为：兔抗大鼠NGF，兔抗大鼠TrkA和兔抗大鼠p75单克隆抗体，稀释度为1∶1 000。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色结果

光学显微镜下观察卵巢内原始卵泡、初级卵泡及有卵泡腔的卵泡（次级和成熟卵泡）的发育及各因子的表达情况。各时间点的卵巢内均有上述3种类型的卵泡。原始卵泡体积较小，在白膜的下方；初级卵泡的体积稍大，无卵泡腔，位置在白膜下较深处，体积大小较均一；有卵泡腔的卵泡，数量较少，位于白膜下方或近白膜处，体积较大，或可见卵丘。其中有卵泡腔的卵泡（次级和成熟卵泡）在8h时，数量最多；前两种卵泡的数量，在各时间点均未见明显量的变化。对黄体数量的观察结果显示，各时间点内均有黄体，黄体体积较大，近白膜。24h及32h时，黄体数量最多，黄体内细胞密集，细胞体积较大；80 h时虽亦检测到黄体存在，但黄体内结缔组织较多，细胞体积较小。

2.1.1 NGF及其受体TrkA和p75在原始卵泡内的表达 免疫组织化学染色结果显示：在各时间点的原始卵泡的卵泡壁及卵母细胞内，NGF及其受体TrkA和p75的表达均呈阴性。见图1。

2.1.2 NGF及其受体TrkA和p75在初级卵泡内的表达 免疫组织化学染色结果显示：NGF及其受体TrkA和p75在各时间点的初级卵泡的卵母细胞内均呈阴性。各时间点的卵壁内NGF及TrkA和p75均呈阳性表达，其中8h时，染色强度最强，见表1，图1。

表1 发情周期内卵巢内初级卵泡内NGF及其受体TrkA和p75的表达

2.1.3 NGF及其受体TrkA和p75在有卵泡腔卵泡内的表达 免疫组织化学染色结果显示：NGF及其受体TrkA和p75在各时间点的有卵泡腔卵泡的卵母细胞及卵泡壁内均呈阳性表达，其中8h和80 h时染色强度较度，见表2，图1。

表2 发情周期内卵巢内有卵泡腔卵泡内NGF及其受体TrkA和p75的表达

2.1.4 NGF及其受体TrkA和p75在黄体细胞内的表达 免疫组织化学染色结果显示：各时间点卵巢内的黄体细胞内均有NGF及其受体TrkA和p75阳性表达。其中NGF和TrkA在24h时表达较强，而p75则在80h时表达最强，见表3。

2.2 mRNA原位杂交结果

mRNA原位杂交结果与免疫组织化学染色结果一致，详见表1、表2和表3，图2。

表3 发情周期内卵巢内有卵泡腔卵泡内NGF及其受体TrkA和p75的表达

2.3 Western blot检测结果

于各时间点，NGF及其受体TrkA和p75的蛋白表达量相似。图3。

图1 8h时NGF在卵巢内的表达（IHC）。阳性细胞内可见棕黑色颗粒。★为有卵泡腔卵泡，▲为初级卵泡，↑为原始卵泡。20×

图2 8h时TrkA在卵巢内的表达（原位杂交）。阳性细胞内可见棕黄色颗粒，▲为初级卵泡，↑为原始卵泡。40×

图3 发情周期内NGF，TrkA和p75蛋白在Wistar大鼠卵巢内的表达

3 讨论

大鼠的性周期一般为4－5天，性周期较规律，可根据阴道涂片检测脱落上皮的发育情况将发情周期分为5期［20］，即发情前期，发情期，发情后期I，发情后期II，及发情间期。一般发情前期可持续9－18小时，发情期可持续6－12小时，发情后期I期可持续18－24小时，发情后期II期，可持续12－24小时，而发情间期一般可持续36－42小时。与卵巢卵泡的发育期存在大致的对应关系为，发情前期为排卵前期，即成熟卵泡形成期；发情期为排卵期，此期，即将排卵；其它三期为生长卵泡发育期。为保证我们选的取材时间点均在发情周期的每个时段内，每一时间点均选在每一期的中期。

卵巢属于女性的内生殖器官，亦属于内分泌腺，可分泌FSH、LH等多种激素，激素的分泌与颗粒细胞，即卵泡壁细胞，以及黄体等结构有关［22］。黄体在人类可分月经黄体和妊娠黄体，月经黄体的存在取决于排出的卵是否受精［22］。在大鼠，非灵长类动物，每孕多胎，每次排卵多个，且没有月经的形成，故黄体退化较慢，长时间内黄体一直存在［20］。人类的卵泡出生时有70－200万个，青春期时，仅剩4万个左右；女性一生只排400多个，其余均于不同阶段退化［22］，大鼠卵巢内亦有类似的退化现象，退化是一种凋亡过程［22］，我们的结果显示各时间点原始、初级及有卵泡腔卵泡的卵泡壁内卵母细胞内p75均有表达，但量有不同，时多时少。有文献报道当有活化的TrkA存在时，p75可与之结合，可强化NGF的作用；当TrkA不存在时，p75可诱导细胞凋亡［2］。我们的实验结果，提示闭锁卵泡的形成可能与p75表达有关。闭锁卵泡可以发生在卵泡各个阶段。同时有相关文献报道NGF可促进性腺的发育［2］。我们的实验结果显示在不同期的卵泡的卵泡壁及卵母细胞内NGF均有一定的表达。众所周知NGF是通过TrkA受体完成调控作用的［2］。我们的实验结果显示对TrkA的检测结果与NGF的检测结果一致。但Western blot结果显示，NGF及其受体在卵巢内表达的总蛋白水平在整个周期内并没有明显的波动，这可能与激素的分泌有关。我们在实验中同时观察到非卵泡细胞，如卵泡膜细胞和间质细胞，NGF及其受体于各时间亦有表达，且表达趋势呈与NGF等在卵泡上的表达趋势相反的现象，数据未统计。

总之，我们观察了发情周期内Wistar大鼠卵巢内NGF及其受体的细胞定位及表达水平，结果显示NGF及其受体均有不同程度的表达，提示NGF及其受体可能对卵泡的发育有促进作用。

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The expression of NGF and its receptors TrkA and p75in ovary during the estrous cycle

WANGXiao-ming，BAIShi，DINGJun.（DepartmentofAnatomyandEmbryologyofTaizhouUniversity，Taizhou318000，China）

ObjectiveTo detect the expression of NGF and its receptors TrkA and p75in Wistar rats ovary during the estrous cycle.MethodsImmunohistochemistry for the localization and protein expression of NGF and its receptors TrkA and p75in ovarian cells；In situ hybridization for the mRNA expression of NGF and its receptors TrkA and p75 in the ovary during the estrous；Western blotting for the protein amount of NGF and its receptor TrkA and p75in the ovary during the estrous.ResultsThe results of immunohisochemistry showed there were different expression levels of NGF and its receptor TrkA and p75in the ovary，included the follicles，oocytes and corpus luteum in the ovary during the estrous；the results of in situ hybridization during the same period showed the same mRNA levels change of them as immunohistochemsitry results showed；but the results of Western blot during the same period showed there were not obviously change of the protein amount change of NGF and its receptor TrkA and p75.ConclusionNGF and its receptors TrkA and p75can promote the development of follicle cells and oocytes in the Wistar rat’s ovary during the estrous cycle.

ovary；NGF；TrkA；p75；follicle

R329.1

A

1007－4287（2012）01－0040－04

＊通讯作者

2010－09－23）