荧光光度法测定福建组培金线莲中总黄酮含量

罗明可 吴水华 柯伙钊

福建生物工程职业技术学院，福建福州 350002

金线莲[anoectochilus roxburghii （wall.）lindl.][1]为兰科开唇兰属植物，又名金线兰、金线草等，民间素有“药王”“金草”“神药”等美称，是福建省和台湾等地极其珍贵、稀少的中药材。金线莲全草药用，味甘、性平，具有显著的清热解毒、祛风除湿、凉血平肝、固肾等功效[2-3]。鉴于野生金线莲具有广泛的临床应用价值，同时为了保护野生资源，近年来福建省已成功开发了金线莲组培快繁技术，并建立了多个金线莲组培基地。目前，对福建组培金线莲的研究主要集中在组培技术的优化方面，而对其活性成分的研究，仅有罗明可等[4]报道。为进一步考察福建组培金线莲的内在质量，本实验参考文献[5-9]，首次采用荧光光度法对福建组培金线莲中的总黄酮含量进行测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Cary Eclipse型荧光分光光度计（美国瓦里安）；AL204型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；KQ-100B型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；AKRY-UP-Ⅲ-10型超纯水机（成都康宁实验专用纯水设备厂）。所用玻璃仪器均用重铬酸钾洗液浸泡24 h后，再先后用自来水、超纯水冲洗干净。

1.2 试药

槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，含量为97.4%）；冰醋酸（HAc）、石油醚（60～90℃）、95%乙醇、结晶氯化铝均为分析纯；分析所用水均为超纯水。福建组培金线莲鲜草购自福建医科大学附属协和医院，经干燥后粉碎过2号筛备用。

2 实验方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 槲皮素标准溶液制备 精密称取槲皮素对照品10 mg，置小烧杯中，用少量95%乙醇溶解后，转入100 mL量瓶中，再用95%乙醇定容至刻度，摇匀，制得浓度为0.1 mg/mL的槲皮素标准溶液。

2.1.2 样品溶液制备 精密称取福建组培金线莲药粉0.5 g，置具塞锥形瓶中，加石油醚（60～90℃）20 mL浸泡24 h后，

2.1.3 试剂溶液制备 醋酸乙醇溶液：精密量取1.43 mL HAc，置50 mL量瓶中，用95%乙醇稀释定容至刻度，摇匀，制得0.5 mol/L的醋酸乙醇溶液，备用。三氯化铝乙醇溶液：精密称取0.912 2 g AlCl3·6H2O，置小烧杯中，用95%乙醇溶解后，转入50 mL量瓶中，再用95%乙醇稀释定容至刻度，摇匀，制得10 mg/mL的三氯化铝乙醇溶液，备用。

2.2 实验条件选择

2.2.1 测定波长的选择 对槲皮素标准溶液及样品溶液进行激发光谱和发射光谱扫描，所得谱图如图1所示。槲皮素和样品在酸性条件下都与AlCl3反应产生荧光物质，激发波长（λex）分别为435 nm和433 nm，发射波长（λem）分别为485 nm和482 nm。因此，确定测定波长：激发波长为435 nm，发射波长为485 nm，狭缝宽度为5 nm。

图1 槲皮素标准溶液及样品溶液荧光光谱图

2.2.2 体系醋酸浓度 在槲皮素、三氯化铝条件不变的情况下，考察了体系中不同醋酸浓度对荧光强度的影响。由图2可知，在本实验中，当体系中醋酸的摩尔浓度较低时，随醋酸摩尔浓度的增大，荧光强度迅速增加，当加入醋酸的摩尔浓度达到0.05 mol/L时，荧光强度达到最大值，然后随着醋酸摩尔浓度的增大，荧光强度降低，故本实验确定加入HAc的量为使体系的醋酸浓度达到0.05 mol/L。

2.2.3 体系三氯化铝浓度 在槲皮素、HAc的条件不变的情况下，考察了体系中不同AlCl3浓度对荧光强度的影响。见图3。在本实验中，当体系中AlCl3的浓度较低时，随AlCl3浓度的增大，荧光强度增强，当加入AlCl3的浓度在0.6～0.7 mg/mL时，荧光强度达到最大值，而后随着AlCl3浓度的增加，荧光强度缓慢降低。故本实验选择加入AlCl3的量为使体系中AlCl3的浓度为0.6 mg/mL。

图2 醋酸浓度的影响

图3 AlCl3浓度的影响

2.2.4 体系乙醇浓度 在槲皮素、HAc和AlCl3的条件不变的情况下，考察了不同浓度乙醇对荧光强度的影响。见图4。由图可知，乙醇的浓度对荧光强度的影响比较大，浓度越高，荧光强度越强，故本实验选择95%乙醇作为溶剂。

图4 乙醇浓度的影响

2.2.5 体系试剂加入顺序 按上述选定条件，考察了试剂加入顺序对荧光强度的影响，结果表明：分别按槲皮素+HAc+AlCl3、AlCl3+HAc+槲皮素、HAc+槲皮素+AlCl3的顺序加入，三者荧光强度均较强，无显著差别（RSD=1.0%），而其余加入顺序的荧光强度均较弱。故本实验选择按槲皮+HAc+AlCl3的顺序加入。

2.2.6 体系稳定性 槲皮素和样品的荧光体系在不同测定时间内荧光强度的变化情况见图5。由图可知，二者荧光强度开始时迅速增强，5～20 min达到稳定，而后随着时间的延长，荧光强度平缓下降，故显色后5～20 min为最佳测定时间，故本实验选择显色10 min时测定。

图5 放置时间的影响

2.3 测定方法

2.3.1 工作曲线的绘制及检出限的测定 精密量取1.0 mL槲皮素标准溶液，置50 mL量瓶中，用95%乙醇稀释定容至刻度，摇匀。精密量取稀释液 0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mL，分别置于10 mL的量瓶中，再分别依次加入0.5 mol/L的HAc乙醇溶液1 mL，10 mg/mL的AlCl3乙醇溶液0.6 mL，用95%乙醇稀释定容至刻度。室温放置10 min。在上述确定的测定波长下测定荧光强度，并对相应的浓度绘制工作曲线。结果表明，在0.002～0.400 μg/mL范围内具有良好的线性关系，回归方程为F=2 002.6C+5.529 6，相关系数r=0.999 5。经测定，此方法的检出限为0.000 4 μg/mL。见图6。

图6 工作曲线

2.3.2 样品测定和回收率实验 按上述最佳实验条件平行测定了福建组培金线莲中总黄酮的含量，并对样品溶液进行平行测定（n=5），按干燥品（经测得福建组培金线莲的含水量为11.3%）计算含量。见表1。

表1 福建组培金线莲总黄酮含量测定结果

为了验证实验的准确性，在样品溶液中加入槲皮素对照品后计算回收率（按未扣除福建组培金线莲中的水分计算含量），由表2可知，采用荧光光度法测定福建组培金线莲中的总黄酮含量，实验结果准确度高。

表2 样品回收率实验结果

3 讨论

从福建野生金线莲中得到大量黄酮类化台物，主要由槲皮素、异鼠李素及其糖苷组成，推测黄酮为该植物中主要活性成分[7-8]。故本实验以黄酮为测定对象，以槲皮素为对照品，测定福建组培金线莲中的总黄酮含量，用以考察福建组培金线莲的内在质量。

利用正交试验设计，以紫外分光光度法检测，对福建组培金线莲总黄酮提取率作了详细考察，得出最佳提取条件，即用40倍量石油醚（60～90℃）浸泡24 h，除去石油醚后，再用20倍量95%乙醇，超声提取3次，每次30 min，加样回收率为100.33%，RSD为1.03%。认为本实验中总黄酮提取较为完全。

福建组培金线莲中富含多酚类物质[9]，若直接用硝酸铝比色法测定其中的总黄酮含量，会使测定结果偏高。采用荧光光度法测定福建组培金线莲中的总黄酮含量，可排除一些常见金属离子的干扰。同时，通过考察溶剂、pH值、三氯化铝加入量、试剂加入顺序、放置时间等因素对荧光强度的影响，进一步提高了测定结果的准确性。

本法操作简便、快速，测定灵敏，结果准确、可靠，检出限比紫外分光光度法及高效液相色谱法低了两个数量级，适用于福建组培金线莲中总黄酮的测定，为正确制定福建组培金线莲的质量标准及合理开发利用提供依据。

[1]福建中医药研究所.福建药物志[M].第2册.福州：福建科技出版社，1982：215.

[2]《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编（下册）[M].北京：人民卫生出版社，1992.

[3]江川，黄玉芳.简述民间草药金线莲的药理作用[J].海峡药学，2007，19（11）：87-88.

[4]罗明可，陈文娟，吴水华，等. GC-MS对不同溶剂萃取福建组培金线莲挥发油的分析 [J]. 时珍国医国药，2010，21（9）：2192-2194.

[5]郭玉梅，杨景和，吴霞.银杏叶提取物中总黄酮含量的分析方法研究[J].山东大学学报，2009，44（5）：40-44.

[6]张志信，张 铁，赵保发，等.文山野生金线莲总黄酮及多糖含量测定[J].时珍国医国药，2009，20（6）：1362-1364.

[7]关璟，王春兰，郭顺星，等.福建金线莲总黄酮提取工艺的研究[J].中国药学杂志，2008，43（21）：1615-1617.

[8]关 璟，王春兰，郭顺星，等.福建产金线莲中黄酮苷成分的研究[J].中草药，2005，36（10）：1450-1453.

[9]关璟，王春兰，郭顺星，等.高效液相色谱法测定金线莲中黄酮含量[J].药物分析杂志，2008，28（1）：9-11.