拟南芥abf3和abf4突变体对ABA和盐胁迫响应

刘 帅，朱明鲲，刘 旭，李 玲

(华南师范大学生命科学学院，广东省植物发育生物工程重点实验室，广东广州510631)

ABF是一类AREB类转录因子，可以与ABA诱导基因的启动子区域结合调节下游靶基因的表达［1］．2000 年，UNO 等［2］和 CHOI等［3］分别从拟南芥中分离出4种bZIP蛋白，其中ABF1主要参与低温、ABA胁迫的应答反应;ABF3主要受 ABA、高盐、低温、热、氧化胁迫诱导;ABF2/AREB1、ABF4/AREB2则主要参与ABA、干旱、高盐、热和氧化胁迫应答反应［2］．AREBs转录因子特异存在于植物中，超表达和abf4突变体植株，分析它们对ABA和盐胁迫响应特点，揭示ABF3和ABF4的功能差异，为深入研究ABF在ABA信号途径的作用提供依据．

1 材料与方法

1．1 材料与处理

哥伦比亚生态型野生型拟南芥(Columbia，缩写为Col)．拟南芥突变体abf3(SALK 127755)和abf4(SALK 069523)购于拟南芥资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)，经本实验室纯化鉴定．

ABA处理:种子消毒后，播种于含有不同浓度的ABA的1/2MS固体培养基上，4℃放置2 d，然后在光照培养箱中(昼夜温度为22°/20°，光照周期为16 h/8 h，平均湿度为40% ～60%)培养．

盐胁迫处理:种子播种于含有 0、100、200 mmol/L NaCl的1/2MS固体培养基上，4℃同步化处理2 d，然后光照培养箱中(昼夜温度为22°/20°，光照周期为16 h/8 h，平均湿度为40% ～60%)培养．

1．2 试验试剂及PCR引物

Taq DNA聚合酶、RNA提取试剂TRizol、DNase I(RNAase-free)、One Step RT-PCR试剂盒均购自TaKaRa;引物合成和PCR产物测序由上海英俊公司完成，名称及序列如下:2Bd3-LP(ABF4)5’-GGGTTTTAGGGCTTGGATGCT-3’，2Bd3-R(ABF)5’-TTCACAGGCGCAGAAAATGCT-3’，ABF3-F 5’-TTGATGGTGTGAGTGAGCAGC-3’，ABF3-R 5’-TGGCAAGAGTTGGACGTTGTG-3’，LBa1 5’-TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG-3’;其他常规试剂均为国产分析纯．

1．3 试验方法

1．3．1 RT-PCR检测 按照 TaKaRa提供的 TR-izol使用方法提取南芥叶片RNA备用，使用one step RT-PCR对基因的转录产物进行基因表达鉴定．程序:50℃逆转录30 min，94℃终止反应2 min，94℃变性2 min，94℃变性 30 s，60℃退火30 s，72℃延伸70 s，28个循环，72℃延伸5 min．质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物．

1．3．2 种子萌发率 种子经春比后，在光照条件下培养1 d后，统计萌发率，每12 h统计1次，重复3次．

1．3．3 绿胚率统计 种子经光照培养16 d统计绿胚率，重复3次．

1．3．4 根长比率 拟南芥在1/2 MS培养基培养至长出2片子叶(约3 d)，点种在1/2MS固体培养基正常板和含质量分数0．8%蔗糖的1/2MS固体培养基上，平板垂直培养8 d，测量主根长度．

1．3．5 气孔开度和开度率测定 3周龄叶片置于气孔开度溶液(KCl 50 mmol/L，CaCl250 μmol/L，MES 10mmol/L，pH 6．15)0．5 h，撕下叶片表皮立即放入固定液(V(无水乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)中为对照叶片．处理叶片置于含10μmol/L ABA的气孔处理溶液1 h后固定，显微镜下拍照记录结果．

1．3．6 叶绿素含量测定 参照李合生等［4］的方法测定和计算叶绿素含量，单位为mg/g．

1．3．7 叶片黄化率统计 植株盐处理采用人工浇盐水的方式．选取规格一致的花盆装入质量相同的土，将在光照培养箱中生长至四片子叶的幼苗移栽入土中，每次实验处理中野生系和转基因系均为32株．在第3周，幼苗长到约12片叶时，进行即分别在第1、第 5、第 9 天分别浇 100、200、300 mmol/L 的NaCl溶液0．8 L，处理后第12～15天拍照，统计叶片黄化率．

1．3．8 盐胁迫叶片鲜重减少率统计 使用1．3．7中的植株，分别在盐处理第1、15天统计叶片莲座叶子鲜重，统计叶片鲜重变化率．

1．3．9 数据统计 数据结果通过Excel 2003分析，T检验双样本异方差分析．

2 结果与分析

2．1 突变体的鉴定筛选

根据abf3和abf4突变体的基因结构图谱(图1 A)为依据合成基因表达鉴定的引物，通过RT-PCR检测突变体中ABF3，ABF4基因表达的电泳图．abf3和abf4突变体株系中相应突变基因在基因表达鉴定中均表达缺失(图1B)，表明基因组鉴定所得的abf3和abf4突变体植株为单基因缺失表达的纯合子，用于后续生理实验．

图1 abf3和abf4突变体的基因结构图谱(A)和分子鉴定(B)Figure 1 Schematic diagram(A)and molecular identification(B)of abf3 and abf4

2．2 突变体对外施ABA的响应

种子在光照条件下培养60 h后，abf3、abf4在没有ABA处理(对照)条件下，其萌发率与Col差别不明显，经 0．1、0．5、1．0 μmol/L ABA 处理的种子，萌发率均高于Col，均表现为对ABA不敏感，说明外源ABA抑制种子萌发通过ABF3和ABF4起作用(图2)．

在正常生长条件下，拟南芥各株系绿胚率均为100%;abf3和abf4经1μmol/L ABA 处理16 d，其绿胚率高于Col(图3A)，abf3绿胚率高于abf4植株，表明abf3和abf4显著降低对ABA的敏感性，ABF3基因在响应ABA信号途径中所起的作用比ABF4明显．

分析ABA处理12 d后突变体和野生型的根长比率，结果表明，用20μmol/L或50μmol/L ABA处理abf3的根长比率都显著高于Col;而20μmol/L ABA处理的abf4的根长比率与Col没有明显变化，但50μmol/L处理的abf4的根长比率低于Col(图3B)．表明与ABF4比较，ABF3基因的根生长在响应ABA信号途径中起到更关键作用的结果．

abf3、abf4叶片经气孔开放乳液浸泡0．5 h后，其叶片的气孔开度均比Col略大，但无明显差异(图4A)．10μmol/L ABA 浸泡1 h处理的 abf3、abf4气孔开率均比Col大，abf4气孔开率变化仅为10%左右．说明 abf3、abf4的气孔对 ABA的敏感性低于Col．ABF3、ABF4均参与ABA信号通路对气孔开度的调节，其中ABF4可能比ABF3起到更关键作用．

2．3 abf3和abf4突变体对盐胁迫响应

在含100 mmol/L NaCl的1/2MS的培养基培养16 d后，与在正常生长条件培养结果相比，abf3和abf4突变体的绿胚率比Col低，abf3对NaCl的相应程度高于abf4(图5)．在150 mmol/L NaCl处理的abf3根长比率比Col高．当NaCl浓度为200 mmol/L时，abf3的根长比率高于Col，而abf4与Col无明显差异．总之ABF3对NaCl的敏感性．

图2 不同浓度ABA处理对abf3和abf4突变体萌发率的影响Figure 2 Effect of applying ABA at different concentration on germination rates in abf3 and abf4 mutants

图3 不同浓度ABA处理对abf3和abf4突变体的绿胚率(A)和根长比率(B)的影响Figure 3 Effect of applying ABA on green cotyledon rates(A)and relative root length(B)in abf3 and abf4 mutants

图4 ABA处理对突变体气孔开度的影响Figure 4 Effect of applying ABA on stomatal aperture in abf3 and abf4 mutants

图5 NaCl处理对突变体的绿胚率(A)和主根长比率(B)的影响Figure 5 Effect of NaCl on green cotyledon rates(A)and relative root length(B)of the ABFmutants and wild-type plants

abf3和abf4突变体在100 mmol/L NaCl处理后叶片的叶绿素含量均大幅度降低，与野生型比较，abf3降低达到极显著水平，说明ABF3、ABF4突变体在拟南芥的抗盐性中发挥重要作用(图6)．

拟南芥植株抽薹前在第1、第5、第9天分别用100、200、300 mmol/L 的 NaCl溶液进行根处理，3 次处理后第3～6 d，abf3、abf4植株叶片的黄化率均高于Col，且 abf3黄化现象极为明显(表1)．盐处理的同时，称量第1天、第15天植株莲座叶的鲜重，abf3、abf4鲜重比正常条件下培养值明显降低，较Col极为明显(图7)．

图6 NaCl处理对突变体叶绿素含量的影响Figure 6 Effectof NaCl on total chlorophyll contents inmutants and wild-type plants

表1 盐胁迫下突变体植株叶片黄化Table 1 Yellowing rates of 3-week-old plants under NaCl stress

3 讨论

目前认为AREB/ABF转录因子属于bZIP转录因子家族中的A亚族，N端含有3个保守的结构域(C1、C2、C3)，C端前端包含1个高度保守的碱性亮氨酸拉链结构，结合DNA和其他蛋白，需要磷酸化修饰被激活［5］．水稻在干旱和高盐胁迫下，存在类似的AREB/ABF调节因子并受到SnRK2磷酸化作用，其中 3个 SnRK2基因被 ABA激活［6］．水稻AREB1类似基因TRAB1被SnRK2蛋白激酶家族成员SAPK磷酸化，通过迅速磷酸化响应ABA［7-8］．

图7 NaCl处理下突变体叶片鲜重变化率Figure 7 Effect of NaCl on frash weight changing rate in mutants under high salt condition

本实验证实在abf3、abf4突变体植株中，叶片气孔不能关闭，对外施ABA信号不敏感．在突变体抗旱性分析实验中，发现abf3、abf4抗旱性均弱于Col植株，表现低抗旱性，可能与ABA的信号转导能力下降有关;KIM等［9］发现超表达 ABF3或 ABF4/AREB2诱导ABA的超敏感，可提高转基因植株的抗旱能力，与本实验结果一致．作者推测ABA应答因子如ABF3或ABF4等通过被SnRK2磷酸化调节蛋白活性，而ABF3或ABF4作为转录调节因子结合在rd29B、rab18、ICK1、ABI1等众多基因的启动子区域［9］，调节气孔开闭，控制水分流失，抵御干旱．正常情况下，拟南芥中ABF3、ABF4在根、叶、花以及未成熟的果荚中均有表达，且根中表达量最高，但ABF3在叶中表达微弱，ABF4在叶中表达较高［10］，推测可能也是abf3中，气孔开度变化较abf4大的原因．

在种子萌发和幼苗生长阶段，abf3和abf4突变体植株对ABA敏感性(萌发、绿胚)较Col弱，在根长方面，abf3突变株对 ABA敏感性显著降低，而abf4对ABA敏感性与Col无明显差异;TAKUYA和YOSHIDA 等［11］通过对 abf2、abf3、abf4 单突变、双突变以及三突变的生理表型分析认为在萌发及幼苗生长阶段，转录因子ABF3在ABA信号通路中起到关键作用．abf4对ABA的敏感性可能是由于ABF2与ABF4功能上的互补［12］，与本实验结果基本一致．

abf3和abf4突变体对NaCl胁迫的敏感性大于Col，NaCl处理后突变体叶片叶绿素含量降低，黄化率增加，均表现出对盐胁迫的低抗性，其中abf3对盐的抗性较 abf4更低．推测 ABF3、ABF4作为SnRK2的底物被磷酸化，调控下游基因的表达，在这一过程中转录因子ABF3可能起着更关键的作用，有待深入研究．

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