结核分支杆菌异烟肼耐药性的杂交检测

亓莹

耐药结核病已成为结核病防控、治疗工作面临的严峻挑战。目前耐药结核病的诊断主要依靠结核分枝杆菌培养、药物敏感性实验，试验周期长，不能满足临床需要。异烟肼、利福平作为一线抗结核药物，其耐药性分子机制的研究成为热点。有报道指出结核分支杆菌对异烟肼耐药是由结核分支杆菌中过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的突变所致，与inhA基因突变也存在着密切联系。我们采用PCR扩增、核酸杂交检测方法对102株临床结核杆菌分离株和35例结核患者菌阳痰标本进行KatG、inhA基因突变检测。

1 资料与方法

1.1 一般资料 42株对异烟肼敏感的菌株，60株对异烟肼耐药菌株、35例耐异烟肼或含耐异烟肼的肺结核患者菌阳菌阳痰标本来自我院就诊的结核患者。异烟肼敏感株、耐药株均通过结核分枝杆菌药物敏感性试验验证。

1.2 方法

1.2.1 结核分枝杆菌DNA模板的制备 刮取少量标本，加入100ulTE中，100℃ 煮沸10min，立即置于冰上2min，10000rpm离心10min，取上清备用。

1.2.2 PCR扩增 采用20ul反应体系，Bio-标记引物，扩增程序为:经过变性、退火、延伸，30次循环，最后延伸72℃、10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭(10ug/ml)。凝胶成像系统检测，出现267 bp条带。

1.2.3 杂交检测 将点有探针的硝酸纤维素杂交膜装入杂交袋中，加入杂交液进行预杂交:45℃、20min。将上一步PCR扩增阳性产物95℃、10min变性，取出迅速放入冰盒中，取变性扩增产物加入杂交袋中，每ml杂交液加l5ul变性的扩增产物，进行分子杂交:45℃、60 min。取出硝酸纤维素杂交膜，洗膜三次、加入显色试剂显色、与标准菌株对比观察报告结果。

2 结果

2.1 肺结核患者痰标本的检测结果 35例耐异烟肼肺结核患者痰标本中，KatG基因扩增阳性有30例、inhA基因扩增阳性27例。应用PCR扩增、核酸杂交检测方法检测KatG、inhA基因突变率分别为43.3%(13/30)、3.7%(1/30)。见表1。

表1 对35例痰标本的KatG、inhA基因突变检测结果

2.2 结核分支杆菌临床分离株的检测结果 42株对异烟肼敏感菌株的KatG、inhA基因突变率分别为4.8%(2/42)、0。60株对异烟肼耐药菌株中，38株发生KatG基因突变，突变率为61.6%;3株发生inhA基因突变，突变率为5.0%。

表2 对102例临床分离株的检测结果

3 讨论

耐药结核病已经成为我国结核病控制的一大难题，若不能有效遏制耐药结核分枝杆菌的播散和流行，将会使更多人感染耐药结核分枝杆菌并形成新的传染源，应尽快提高我国耐药结核病的诊断水平，引入新的快速、可靠和便捷的耐药结核病的诊断技术，缩短耐药结核病的诊断时间。研究表明结核分支杆菌耐异烟肼的分子机制是过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变所致，与inhA基因突变也存在密切联系。本文通过PCR扩增、核酸杂交方法进行KatG、inhA基因突变检测，使耐药性检测时间由2～3个月缩短到2～3 d。

PCR扩增、核酸杂交技术检测结核分枝杆菌的KatG、inhA基因突变，42株对异烟肼敏感菌株中，发生KatG基因突变的2株，没有inhA基因突变。发生KatG、inhA基因突变率分别为4.8%、0。60株对异烟肼耐药菌株中，与标准菌株相比，发生KatG基因突变38株，突变率为61.6%;发生inhA基因突变3株，突变率为5.0%，突变类型均为点突变。对异烟肼耐药的肺结核患者菌阳痰标本中，KatG、inhA基因突变检出率分别为43.3%(13/30)、3.7%(1/27)，略低于临床分离株，这与相关报道一致。由于本实验中有4.8%的敏感株也存在突变，说明KatG、inhA基因突变是导致异烟肼耐药的主要原因，但有部分菌株的耐异烟肼形成可能与KatG、inhA基因缺失、突变无关，还需要进一步研究探讨。本实验也验证了大部分结核分支杆菌对异烟肼耐药是由KatG基因、inhA基因的突变所决定。

本文建立一种新的快速，有效的对异烟肼耐药的分子检测方法。为耐药结核病的早期诊断、早期治疗具有重要的意义。应用PCR扩增和核酸杂交检测技术也可以直接检测菌阳痰标本中结核杆菌KatG、inhA基因突变情况，来判断结核分支杆菌异烟肼的耐药性，为耐药、耐多药肺结核提供诊断依据。