微生物检测技术及其在食品安全中的应用

李勤

（四川工商职业技术学院，四川 都江堰 611830）

近年来在不同的国家和地区相继发生了许多与食品有关的安全问题，如1991年中国上海发生的毛蚶甲肝病毒导致30万人中毒，1994年美国发生的肠炎沙门氏菌污染巴氏消毒液态冰淇凌导致22万人中毒，1996年日本肠出血性大肠杆菌O157：H7导致9450人中毒等。据2012年2月2日，我国卫生部通报，2011年第三季度，我国共报告食物中毒类突发公共卫生事件73起，中毒3224人，其中死亡61人；按中毒原因分类，微生物性食物中毒事件的报告起数和中毒人数最多，分别占总报告起数和中毒人数的47.9%和70.7%。随着人们生活水平的提高，安全意识的增强，对食品安全提出了更高的要求，食品安全已成为全球关注的焦点，现代食品微生物检测技术的发展和在食品安全检测中的应用也越来越受到人们的重视。

1 现代食品微生物检测技术研究的主要内容

现代食品微生物检测技术是以微生物学为基础，运用现代免疫学、分子生物学、自动化仪器、生物传感器等方面的理论和技术，研究食品中的微生物，特别是病原微生物的种类、数量、性质等，并建立的现代食品微生物检测方法。该方法具有简便、快速、准确、高效、灵敏度高等特点，可以快速检出食品中的病原微生物，迅速对食品的卫生质量进行评价。

现代食品微生物检测技术研究的内容主要有：食源性病原菌免疫学快速检测技术、食源性病原菌分子生物学快速检测技术、生理生化代谢产物的检测技术、食源性病原菌自动化检测技术、食源性致病菌生物传感器检测技术[1]，分别简要介绍如下。

1.1 食源性病原菌免疫学快速检测技术

1.1.1 荧光抗体检测技术（FAT）

FAT技术是根据抗原抗体反应的基本原理，用荧光素来标记抗体或抗原再与待测样品中的抗体或抗原结合，通过荧光显微镜观察的一种方法。该法有直接法和间接法两种，直接法是在待测样品上直接添加已知荧光素标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察的一种方法。间接法是在待测样品上滴加己知细菌的特异性抗体，与样品反应后经洗涤，再加入荧光标记的第二、第三抗体的方法。如抗沙门氏菌的荧光抗体，可用于750例食品样品的检测，检测结果与常规培养法基本一致[2]。该方法简单、快速，但有时会受到样品中非特异性荧光的干扰影响结果，且荧光显微镜较昂贵。

1.1.2 免疫酶技术（EIA）

免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原，来检测相应抗原或抗体的一种免疫技术。目前用的较多的是酶联免疫吸附技术（ELISA）。该技术是使抗原或抗体吸附于固相载体上，加入酶标记的抗体或抗原，再加入酶的底物，使反应在固相载体上进行，酶和底物反映生成有色产物，有色产物的量与加入的抗原有关，根据产物颜色的深浅便可定量测定[3]。该技术具有速度快、灵敏度高、特异性强、准确性好等特点。

1.2 食源性病原菌分子生物学快速检测技术

1.2.1 基因探针技术

基因探针是指用同位素、生物素、地高辛等可检测标记的一小段已知序列的寡聚核苷酸。其原理就是通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，把目的基因找出来。探针标记分同位素和非同位素两种。同位素标记探针的特异性强，检测病原微生物的速度快。但同位素标记因为放射性污染、核酸探针半衰期短，需要特别的安全防护，对人体有危害；受紫外线照射易分解；临床标本（如食品）中的内源性生物素化蛋白质和其它糖蛋白质常引起背景加深和非特异性反应,所以在使用中受到一定限制。非同位素标记刚好解决了这些问题。

1.2.2 多聚酶链反应（PCR）技术

PCR技术是指体外酶促合成特异DNA片段的一种技术，由高温变性—低温退火（复性）—适温延伸形成一个循环周期，使目的DNA迅速扩增。PCR技术可将研究的目的基因或DNA片段在几小时内扩增到十万至百万倍，用肉眼就能直接观察到。大大缩短了检测时间，几小时便可以完成。在一定程度上解决了核酸探针存在的问题。具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时、易自动化等特点。因此PCR检测技术在食品安全检测中得到了广泛的应用，如检验粮食、食品、花果是否安全，是否含有危险或潜在的病原微生物等。

1.2.3 生物芯片技术

又可称作DNA微阵列（DNA microarray）。

生物芯片技术指由按照预定的位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子（CDNA分子、寡核苷酸分子等）所组成的微点阵阵列。首先把样品中的核酸片段进行标记，在一定条件下，来自样品的互补核酸片段可以与载体上的核酸分子杂交，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。基因芯片技术实际上是高度集成化的反向斑点杂交技术，它解决了传统核酸印迹杂交自动化程度低、操作复杂、检测目标分子数量少、成本高、效率低、结果客观性差等问题[4]。但该技术由于芯片制作的复杂、样品制备和标记复杂，所以在食品微生物检测中还没有广泛的应用，因此在病原微生物检测中具有很好的发展前景。

1.3 生理生化代谢产物的检测技术

1.3.1 电阻抗法

电阻抗法的原理是细菌在生长的过程中，能将大分子物质降解成活跃带电的小分子，通过测定阻抗微弱的电变化，便可测出相应的细菌数量。该法快速、方便、灵活、可靠。

1.3.2 微热量计法

微热量计法是利用细菌生长时会产生热量，根据热量的变化来鉴别细菌。不同的细菌产生的热量不同。该法快、便宜。

1.3.3 放射测量法

放射测量法是利用细菌生长时将碳水化合物分解产生CO2，根据这个原理把微量的放射性标记物引入碳水化合物分子中，当细菌生长时，会放出含有放射标记的CO2，放射量与菌数成正比，可测定食品中的细菌。此法快速、准确[5]。

1.3.4 接触酶测定技术

接触酶测定技术的原理是通过计算一个含有接触酶的纸盘，在盛有H2O2的试管中根据漂浮时间来估计菌数。接触酶与H2O2发生反应放出氧气，样品接触酶阳性细菌含量越高，放出的氧气越多，纸盘上浮的时间越短；反之，纸盘上浮的时间就越长。接触酶多数腐败微生物是嗜冷性细菌，多数嗜冷细菌接触酶呈阳性，所以可以用接触酶反应来测定食品中的嗜冷性细菌。

1.4 现代化仪器对食源性病原菌的自动化检测技术

1.4.1 ATB Expression细菌鉴定及药敏智能系统

该系统是用于细菌快速鉴定的主要仪器。能鉴定常见的肠道菌、非肠道革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及厌氧菌外，还可鉴定单核增生李斯特菌在内的6种李斯特菌、空肠弯曲在内的18种弯曲菌蜡样芽孢杆菌、炭疽杆菌在内的24种需氧芽孢杆菌、淋球菌在内的10种奈瑟菌和嗜血杆菌、52种乳酸杆菌等，可见其实用范围的广泛。该技术结果准确、菌广、速度快、轻松、灵活方便、成本低廉。

1.4.2 全自动微生物快速鉴定仪器VITEK

该系统是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器。可鉴别405种细菌。它有高度的特异性、敏感性和重复性，操作简便、检测速度快，绝大多数细菌的鉴定检测时间在2 h～18 h。

1.4.3 全自动微生物总数快速测定仪器（又名ATP荧光仪）

该仪器是专门用于快速检测微生物数量的测定仪器，简单实用，能快速和方便得到微生物的增长水平，及时采取有效措施控制微生物的繁殖，从而可以有效防治微生物大量繁殖引发的一系列问题。

1.5 食源性致病菌生物传感器检测技术

生物传感器是一种含有固定化生物物质如酶、抗体、细胞、细胞器或复合体等与一种合适的换能器紧密结合的分析工具或系统，用以将生化信号转化为电信号并使其数量化。食源性致病菌生物传感器检测技术就是利用致病微生物在呼吸过程中产生电子的生物传感器，产生电流，而电流的大小与测定液中微生物浓度有关，从而测定出微生物致病菌的含量。比如：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、产气荚膜梭菌和蜡样芽孢杆菌都是常见的病原菌，用这种方法检测，只需几分钟，检出限为0.1ng/mL～1ng/mL，可以用于细菌毒素、真菌毒素的检测。

2 现代食品微生物检测技术在食品安全检测中的应用

食品安全有广义和狭义两种概念，广义的食品安全内容包括卫生安全、质量安全、数量安全、营养安全、生物安全、可持续性安全六大要素，狭义的食品安全指卫生安全[6]。本文主要就是指卫生安全方面的应用。食品安全是遍及全球公共卫生安全的重大问题，食品污染和食源性疾病在发达国家和不发达国家均普遍存在，发病率持续增高，且新的病原体感染不断出现。据调查与任何一类疾病相比，由病原微生物引起的食源性疾病是危害最大的一类。而食品微生物检验是衡量食品安全质量的一个重要指标，也是判定被检食品能否食用的科学依据，所以要求及时准确的检测出食品中的病原微生物。

2.1 食源性病原菌免疫学检测技术在食品安全检测中的应用

免疫学检测技术的仪器装置相对造价低廉，操作简便，实用性强。在食品微生物检测方面已得到普遍使用。如常见的污染食品病源细菌：沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌、葡萄球菌以及所产生的毒素；真菌中的黄曲霉素；食源性寄生虫等的检测。

2.2 核酸探针技术在食品安全检测中的应用

用核酸探针可以快速检测李斯特菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺菌等。如检测单增李斯特菌，可以不受待测样纯度的影响，直接进行检测。Fillal等从染色体序列和质粒中分离出检测沙门氏菌的探针。该技术比较复杂，费用高，很多只能在实验室进行。

2.3 多聚酶链反应（PCR）技术在食品安全检测中的应用

PCR技术具有快速、特异性强、敏感度高等特性，在食品致病菌检测方面具有广阔的应用前景。可以检测食品中的沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、肉毒梭状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增多性李斯特杆菌等。比如：Fu等[7]采用免疫磁珠法和实时荧光定量PCR技术结合不经富集培养即可准确、快速检测出大肠埃希氏菌O157：H7，Berrada等[8]定量检测出色拉中的李斯特菌。翁文川等[9]利用FQ－PCR技术对31株不同菌株的检测中发现，有8株副溶血弧菌为阳性，而其另外23珠菌株为阴性。张霞等[10]通过实时荧光PCR检测到了奶粉中坂崎肠杆菌

2.4 生物芯片技术在食品安全检测中的应用

生物芯片可在一次性实验中检出多种潜在的致病菌，可以对食品中的致病菌实行高通量的检测，一次实验即可得出全部的检测结果，操作简单、快捷、特异性强、敏感性高，全部检测在几小时内就可完成。比如，张伟等将15种细菌16srDNA用引物扩增后与芯片上的探针杂交可以直接检测食品中的致病菌，且只需6 h。但由于芯片的复杂性，大多数处于试验阶段，还没有得到广泛应用。

2.5 生物传感器检测技术在食品安全检测中的应用

污染食品的微生物种类很多，主要包括细菌、真菌和病毒，其中以细菌最为常见。污染食品的微生物分为腐败菌和病原菌，腐败菌本身不致病，主要通过对食品成分的分解和破坏，产生有毒有害物质从而多人体造成危害。而生物传感器检测技术能快速检测微生物比如：酿酒酵母、乳酸菌、枯草芽孢杆菌等常见的食品腐败菌的数量；病原菌如：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、产气荚膜梭菌、和蜡状芽孢杆菌等污染食品的病原菌；生物毒素比如：细菌毒素、藻类毒素、真菌毒素、以及其它毒素的检测。特别是黄曲霉毒素B1（AF B1）是目前所发现的毒素最强的真菌毒素，通过光纤免疫传感器来测定花生和玉米粉可得低达0.05μg/L的AFB1。但该技术还未真正用于食品安全检测。

3 现代食品微生物检测技术在食品安全检测应用中的发展趋势

现代食品微生物检测技术最突出的特点就是依靠高新技术，大量采用仪器设备，更加注重快速、准确、实用。食品微生物检测仪器是食品检测技术的载体，主要体现在微型化、低能化、功能专用化、一体化和成像化。现代食品微生物检测技术与生物技术成果相结合，比如：核酸探针技术、PCR技术在微生物检验方面有广泛的应用。尽管现代食品微生物检测技术在食品安全检测中有一定的应用，但很多的技术还没有真正在食品安全检测中使用。比如：生物芯片技术、生物传感器。因此要完全把现代食品微生物检测技术应用到食品安全检测中还有一个试验和发展过程，还需继续开发和完善。比如：核酸探针杂交与PCR联合使用，若能克服两者存在的易污染、产生的假阳性等问题。今后还应该大力发展在线无损的食品微生物检验技术，那些破坏性的或侵入性的微生物检测手段将逐步被淘汰，而无损的可以进行原位检测的食品微生物检测技术将越来越受到欢迎，如生物传感器等。随着科技的发展，更多微生物检测技术会广泛应用于食品的检测，对食品安全将会发挥更大的作用。

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[5]王伟华,张新武,周靖波,等.食源性微生物快速检测研究进展[J].食品安全检测快报,2011,17(12):182-186

[6]刘学文.食品科学与工程导论[M].北京:化学工业出版社,2007:207

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[8]Berrada H,Soriano J M,Picó Y,et al.Quantification of Listeria monocytogenes in salads by real time quantitative PCR[J].International journal of food microbiology,2006,107:202-206

[9]翁文川,焦红,王方金,等.食品中副溶血弧菌荧光定量PCR方法快速检测[J].中国公共卫生,2005,24(11):1359-1362

[10]张霞,高旗利,罗茂凰,等.实时荧光PCR对奶粉中坂崎肠杆菌的检测[J].中国卫生检验杂志,2006(2):214-216