生物传感器在食品安全中的应用

孟邵华，高丽娟，罗马慧，王鸿飞，胡富陶，*

（1.宁波大学生命科学与生物工程学院，浙江 宁波 315211；2.宁波大学材料科学与化学工程学院，浙江 宁波 315211）

随着经济全球化进程的加快，食品安全已成为当今世界性公共卫生热点[1]。食品中致病菌如大肠杆菌O157∶H7、李斯特氏菌、伤寒沙门氏菌等在条件合适时增长极快，可引发各种流行性疾病。美国疾病控制和预防中心（CDC）估计，美国每年由上述几种致病菌造成大约7600万例疾病，3215万例住院治疗，5200例死亡[1]，而由此造成的医疗花费和生产力损失，每年达29亿～67亿美元[2]。因此对其进行实时在线监测对于食品安全意义重大。通用的检测方法由分离培养、镜检观察、生化鉴定等组成，步骤繁琐且精度低。聚合酶链反应法，酶联免疫吸附法等也均需通过富集、分离、形态学检测、生物化学和血清学测试来鉴别，虽比传统方法需要的检测时间短，但仍达不到实际要求。因此建立一种快速、方便、可靠的食品中主要致病菌安全检测技术，以防止传染疾病和经济损失，是一个迫切的需求。生物传感器因其特异性好、分析速度快、成本低，在食品安全检测领域正发挥着重要的应用价值。

1 生物传感器的原理及优点

生物传感器是将生物识别元件和信号转换元件紧密结合，从而检测目标化合物的分析装置[3]。其基本原理为：待测物质和分子识别元件特异性结合，发生生物化学反应，产生的生物学信息通过信号转换器转化为可以定量处理的电、光等信号，再经仪表放大和输出，从而达到分析检测的目的。

与传统的分析方法相比，生物传感器具有如下优点[4]：①敏感物质经固定化可重复使用；②检测样品一般不需要进行预处理，除缓冲液外无需其他试剂；③样品中被测组分的分离和检测可以同时完成，分析操作简单；④可以实现连续监侧，容易实现自动化测量；⑤响应快，样品用量微；⑥对样品的清晰度(即样品的混浊程度)不作要求，生物传感器可以检测较混浊的样品，而不影响测定结果；⑦传感器连同侧定仪的成本远低于大型分析仪器，便于推广普及。鉴于这些优点，目前己经在农业、医药卫生等领域广泛应用。在食品领域中，生物传感器更是各学者研究的热点。

2 生物传感器在食品安全检测中的应用

2.1 食品中致病菌的检测

Koubova魦和VGertie等[5]实现了用SPR生物传感器实时检测肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis）和单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes）。该传感器的检测限是106cells/mL，灵敏性和标准ELISA相当。

Liu等[6]用免疫磁分离技术和吸光率的测量实现了Escherichia coliO157∶H7的快速检测,总检测时间不超过2 h。

Su等[7]研究了一个灵敏的、特定的、快速检测E.coliO157：H7的方法,该方法同时采用量子点（QDs）作为荧光标记和免疫磁性分离技术。研究结果表明：在103cfu/mL～107cfu/mL范围内，荧光发射强度的峰值和E.coliO157∶H7的初始细胞浓度成比例，检测限比FITC方法至少要低100倍。总检测时间少于2 h。

Leonard P等[8]采用Biacore 3000生物传感器来检测Listeria monocytogenes。他们首先将Listeria monocytogenes细胞和抗体孵育一小段时间，接着用逐步离心法来分离未被绑定的抗体。自由抗体流过经修饰的传感芯片表面，由此产生的响应信号与抑制细胞的浓度成反比。30 min内，检测限可达到1×105cells/mL。研究表明，该方法简单、快速，并且只需少量的样品准备。这种检测方法能够在样品有限的情况下，实现快速、灵敏的致病菌检测。

Subramanian等[9]研究了表面等离子体共振（SPR）免疫传感器检测E.coliO157∶H7的灵敏性和特异性。他们采用自组装膜法固定抗体，把纯单克隆或者多克隆抗E.coliO157∶H7抗体固定到传感器芯片表面，并对E.coliO157∶H7进行直接检测和抗体夹心检测。他们研究了蛋白G检测的效果和不同浓度的一抗、二抗下“三明治”检测的效果。研究结果显示：“三明治”检测方法中,该传感器的检测限可达到103cfu/mL，且对肠炎沙门氏菌有很高的特异性。直接检测和蛋白G检测的检测限分别是106cfu/mL和104cfu/mL。因此，他们得出结论：基于烷烃硫醇自组装膜的SPR生物传感器采用“三明治”方法,能够快速、特定的检测E.coliO157∶H7。

王凯等[10]使用集成化手持式Spreeta TM SPR传感器快速检测沙门氏菌，利用亲和素-生物素系统保证检测的准确性；利用沙门氏菌抗体的免疫吸附反应，保证结果的特异性；并引入复合抗体作为第二抗体以扩大检测的响应信号，检测到鼠伤寒沙门氏菌的浓度为105cfu/mL，整个检测过程在1 h内完成,从一定程度实现了食品中病原微生物的快速检测。

李杜娟等[11]建立了一种采用电化学阻抗谱技术快速检测大肠杆菌O157∶H7的生物传感器，通过石英晶体金电极表面附着一层蛋白A膜来固定抗体的。该生物传感器采用了三电极系统—工作电极石英晶体金电极、Ag/AgCl/Cl-SAT参考电极和铂对电极。试验结果说明抗体的固定以及大肠杆菌O157∶H7与抗体的结合都增加了石英晶体金电极表面的电子传递阻抗，在[Fe（CN）6]3-氧化还原对存在的情况下，用电化学阻抗谱测量该阻抗。该免疫生物传感器的检测限是103cfu/mL，石英晶体金电极的电子传递阻抗变化值和大肠杆菌O157∶H7的浓度在一定范围内呈线性关系，检测时间少于10 min。

2.2 食品中农兽药残留检测

Zheng等[12]研制了一种基于固定化鸡肝酶的流动注射量热式生物传感器检测敌敌畏残留。他们用鸡肝酶代替乙酰胆碱酯酶作为生物识别元件,反应温度固定在40℃。当底物通过注射阀注入到系统中时，在酶反应室里发生催化反应，非酶反应产生的热通过参比室用来排除。用热电偶的传感器测量2个反应室的温度变化。在敌敌畏浓度为1 mg/L和10 mg/L的情况下,酶反应的抑制率分别为30.7%和41.8%。实验证明这种量热式生物传感器可用作农药的快速检测。

蒋雪松等[13]建立了一种压电免疫生物传感器结合流动注射的方法检测样品中的农药残留。为了有效地捕获有机磷农药抗原，比较了3种在石英晶体金电极表面上固定有机磷单克隆抗体的方法。实验表明：在0.005μg/mL～10μg/mL范围内，有机磷浓度与晶体频率的变化之间呈较好的相关关系。回归方程：y=5.9111ln（x）+51.979，决定系数为：0.93。该传感器的最低检测限为2.16×10-3μg/mL，选择性好，可以重复使用。

MAURIZ[14-15]等制备了毒死蜱的单克隆抗体，并运用SPR生物传感方法检测了饮用水中的有机磷农药毒死蜱，最低检测限为55ng/L，此外该研究小组还运用SPR方法测定了水中的有机氯农药DDT、有机磷农药毒死蜱和氨基甲酸酯类农药化合物，各自最低检测限分别为 20、50、0.9ng/L。

黄强力等[16]利用SPR生物传感器快速检测动物源性食品中残留的醋酸甲羟孕酮（MPA），对抗原的固定条件、抗体的浓度及芯片再生条件进行了优化，同时对抗体的稳定性及特异性进行了分析。结果显示，该方法检测的最低限约为1ng/mL。利用模拟标本进行平行测试表明,其与进口ELISA检测试剂盒结果基本一致。SPR生物传感器检测MPA，单个样品的检测时间小于5 min，非常适合现场的快速检测，具有广泛的应用前景。

李辉等[17]利用表面等离子体共振生物传感器对莱克多巴胺抗体与固定在芯片表面的莱克多巴胺衍生物的相互作用进行了分析，解离常数为2.56×10-6/s。根据一定范围内相对响应值和时间近似呈线性关系的动力学特性，建立了连续检测的方法，从而简化了实验步骤，有利于提高芯片的使用寿命。检测莱克多巴胺采用抑制法，将莱克多巴胺衍生物固定在芯片的表面，莱克多巴胺抗体与样品混合后流过芯片的表面，所得相对响应值与样品中莱克多巴胺的浓度成反比。单个样品的检测时间设定为15 min，对应的检出限小于 4μg/L。

2.3 食品中其他物质的检测

Gustavsson等[18]用基于生物传感器的表面等离子共振（SPR）设计了检测牛奶中β-内酰胺类抗生素的实验。将带有羧肽酶活性的微生物受体蛋白用作探测分子，在β-内酰胺类抗生素存在时，受体蛋白和抗生素之间形成稳定的复合物，抑制了蛋白酶的活性，从而可以通过酶活性的降低值，定性地检测出牛奶中的青霉素G。这种方法的检测极限为2.6μg/kg，低于欧洲4μg/kg的最大残留限（MRL）。

Carla C Rosa等[19]利用光学生物传感器对亚硝酸盐进行检测，用络合沉淀凝胶法（CPG法）将一种亚硝酸盐还原酶固定在光纤一端的可控微孔玻璃珠上，当亚硝酸盐与酶发生接触反应时，会发生一系列分光变化，且这种光学变化与亚硝酸盐的浓度在一定范围内呈线性关系，通过检测这些光学变化即可对亚硝酸盐进行定量分析。其检测限为0.93 mol/L，大大低于欧盟所要求的最大限量2.2 mol/L。

上海交通大学农业与生物学院的研究人员根据竞争酶免疫反应原理设计的传感器在检测肉类食品中的激素残留获得了较好的效果。其设计的己烯雌酚传感器是由过氧化氢电极和己烯雌酚抗体膜组成,将一定量的过氧化氢酶标记的己烯雌酚加到待测样品中,酶标记的及未标记的己烯雌酚会与膜上的己烯雌酚抗体发生竞争反应,测定酶标己烯雌酚与抗体的结合率便可知食品中己烯雌酚的含量[20]。

Carter等[21]利用光纤免疫传感器来测定花生和玉米抽提物中的AFB1，检测限可达0.05ng/m L。

Kreuzer等[22]用酶免疫传感器法检测河豚毒素（TTX）。实验结果:线性范围为0.1ng/mL～100ng/mL，最低检出限为0.016ng/mL。

Frevert等[23]采用荧光标记抗体生物传感器测定肉毒梭菌毒素，利用抗原固定化到波导表面上，并与荧光标记抗体反应，样品中游离抗原抑制抗体的结合，从而利用荧光强度的降低，达到定量分析的目的，结果表明该方法可测定200ng/mL的毒素。

Rasooly等[24]用抗体作为检测器做成了一个实时生物传感器，用于检测牛奶、热狗等食品中的葡萄糖球菌肠毒素，灵敏度可达10ng/g～100ng/g，而且检测过程不超过4 min。

石婷等[25]采用基于表面等离子体共振技术的光学传感器，通过自组装分子技术将单克隆抗体固定到传感器金膜表面用于检测对应抗原，即待测抗生素，并记录传感器表面液体折射率的变化曲线，其反映了被吸附抗生素的浓度的大小。对不同浓度的氨苄青霉素水溶液进行了测定，得到该传感器的工作曲线，整体工作曲线呈单调上升，且线性关系较好，同时得到了该检测方法的最低检测极限为1.25ng/mL，明显低于欧盟规定的最大残留限量（4μg/kg）。

3 展望

食品安全检测过程中，常常经过繁杂的前处理，需要大量复杂、昂贵的仪器，且难于实现现场检测，生物传感器的研发和使用不仅减少了分析时间，提高了灵敏度，使测定过程变得更为简单，便于实现自动化。但因其起步较晚，针对目前的研究现状与发展实际，在实际推广应用前，还有许多需要探索和改进的地方。开发新一代低成本、高灵敏度、高稳定性和高寿命的生物传感器已成了目前研究的热点。相信不久的将来，随着生物学、化学、物理学、电子学、材料等技术的不断进步,生物传感器将在食品安全检测和整个农业工程领域里被广泛应用。

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