脐血间充质干细胞及其在新生儿缺氧缺血性脑病治疗中的应用研究

白小红，张德双 综述，陈 娟审校

(四川大学华西第二医院新生儿科，四川 成都 610041)

新生儿缺氧缺血性脑病(Hypoxic-Ischemia Encephalopathy，HIE)是新生儿期常见且危害严重的疾病。重度HIE可以导致新生儿死亡及儿童脑瘫、智力落后、癫痫等神经系统后遗症［1］。HIE发病机制复杂，其治疗及防治远期后遗症已成为临床一大难题。近年干细胞治疗神经系统疾病方面取得的进展，使其可以成为HIE的新的治疗模式［2］。脐血间充质干细胞(Human umbilical cord blood-mesenchymal stem cells，HUCB-MSCs)在一定条件下可以分化为神经元，利用HUCB-MSCs移植对已经坏死的神经元进行替代，最大程度减少重度HIE患儿的远期后遗症。本文对 HUCB-MSCs的基础研究以及HUCB-MSCs治疗HIE方面的进展进行综述。

1 HUCB-MSCs的研究进展

间充质干细胞是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，存在于骨髓、脐血、脂肪等组织。MSCs在体外诱导条件下不仅可以分化为中胚层来源的细胞如成骨细胞、脂肪细胞等，而且可以跨胚层分化为神经细胞［3，4］。Erics等［5］于 2000 年报道，从脐带血中分离出两种贴壁细胞，一种为破骨细胞样，另一种为成纤维细胞样，后者表达细胞表面抗原 SH2、SH3、SH4、ASMA、MAB1470、CD13、CD29 和 CD49e，与骨髓来源的MSCs相同，因此这种细胞也属于间充质干细胞。实验证明，脐血MSCs以及脐带MSCs都可以分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肝细胞骨骼肌细胞［6，7］。骨髓和脐血是 MSCs的两个主要来源组织。脐血又有以下优点:脐血的采集方便，采集脐带血对产妇及新生儿不会造成危害;脐血中的干/祖细胞较成人骨髓中的干/祖细胞增殖分化能力更强［8］;脐血中的淋巴细胞幼稚，免疫功能不完全，移植物抗宿主病的发生率低［9］;脐血中不会有肿瘤细胞;脐带血中潜伏性病毒和病原微生物的感染及传播概率相对较低［10］。因此，脐血是较骨髓更为理想的MSCs的来源组织。

1.1 HUCB-MSCs的分离 目前，HUCB-MSCs分离常使用的方法有以下几种:①密度梯度离心法及贴壁细胞分离法:首先从脐带血中分理处单个核的细胞，再根据其体外培养中贴壁生长的特性，使用贴壁筛选法将其从造血系统中分离出来。此法简单有效，成本低廉，对细胞的损伤小，能较好的保持细胞活性，其缺点则是分离出来的细胞成分复杂，纯度不高。②免疫磁珠分离法:其原理是利用表面附有特异性抗体的磁珠与间充质干细胞结合，再用永久磁铁吸引出间充质干细胞，这样分离出来的细胞纯度较高，而且分离过程中不会影响细胞的活性。③流式细胞仪法:根据干细胞体积大小的不同或是细胞表面的特殊标志将脐血中的各种细胞分离，采用此法分离，可以获得纯度很高的干细胞，但是对干细胞活性影响很大，并且实验条件要求高，所需的标本量大这也限制了此种方法的广泛运用于干细胞的分离，但是其对间充质干细胞的鉴定有很大的作用。国外还有人运用单克隆的方法获得纯的MSCs细胞株，但是该方法不便于大量获得MSCs［11］。

1.2 HUCB-MSCs的培养 HUCB-MSCs的培养具有一定的难度，培养成功率仅在25%左右［12］，且在培养方面目前还有很多争议，尚无统一的方案。影响脐血MSCs培养效率的因素很多，除了脐血中所含MSCs数量较少的原因外，不同的培养基、pH值、胎物血清浓度和种植浓度都会影响MSCs的生长。Romanov等［13］用含10% 胎牛血清的LG-DMEM 培养基养出优质生长良好的间充质干细胞。Lee［6］用含20%牛血清、L-谷氨酰胺的IMDM培养基，并加入碱性成纤维生长因子(bFGF)，也培养出生长良好的干细胞。Ramasamy等也发现在培养基中加入bFGF可以提高干细胞的增殖，使更多的细胞停留在S期，并且不会改变脐血MSCs的免疫表型及免疫调节蛋白的功能［14］。有研究发现，运用人自体血小板裂解物(humanplatelet lysates，HPL)培养的MSCs的免疫表型以及所在生物特性与用10%胎牛血清所培养的一致，7.5%HPL可以促进 MSCs的增殖［15，16］。Zhu等对比不同培养基对 MSCs增殖分化的影响，发现低浓度的胎牛血清(2%)加上EGF，血小板衍生生长因子(PDGF)所构成的培养基可促使MSCs增殖，而15%的胎牛血清加上β-巯基乙醇则可以增加MSCs向成骨细胞的分化［17］。

1.3 HUCB-MSCs诱导分化成为神经细胞 大量实验证明，在不同诱导条件之下，脐血MSCs可以向神经细胞分化。Lim等［18］证实，用脑源性神经营养因子(BDNF)可以刺激人脐血MSCs向神经元分化，且分化的细胞依赖MAPK/ERK和P13k/Akt的信号途径生存。有人发现，激活蛋白激酶(PKA)信号途径增加环磷酸腺苷(cAMP)的含量，可以增加脐血MSCs神经突样结构和神经标志基因的表达［19］。也有实验［20］证明，HUCB-MSCs经诱导可以在形态学、表型及功能上都能分化进入到施万细胞。侯玲玲等［21］采用抗氧化剂诱导发现，MSCs经经诱导后可以表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)和神经丝蛋白(NF)。Kang等［22］发现，雌激素也具有诱导脐血MSCs向神经元分化的功能。Ma等发现运用β-巯基乙醇或者丹参都可以体外诱导人脐带Wharton's Jelly来源的MSCs像神经元分化，并且所分化的细胞表达β-tubulinⅢ、NF和GFAP等成熟神经元标志蛋白［23］。虽然脐血MSCs可以向神经细胞分化，但是所分化的神经细胞是否具有正常神经元一样的生理生化功能以及分化成的神经细胞是否能够长期存活，这些问题仍需要进一步研究。

2 HUCB-MSCs在新生儿HIE治疗中的应用

缺氧缺血所致的脑损伤分为两个阶段:原发性损伤阶段(4～6 h)和继发性损伤阶段(6～72 h)。原发性损伤阶段主要是由于缺氧，细胞能量代谢失衡，酸中毒，谷氨酸盐释放，细胞内Ca积累，脂质过氧化作用和NO的神经毒性破坏细胞的平衡，最终导致的细胞死亡。继发性损伤则是由于兴奋性中毒、神经元的凋亡、以及星形胶质细胞的反应性激活所引起。据其发病的特点，目前主张在“三项支持，三项对症”的基础上加亚低温疗法，可以降低大脑和机体的代谢率，节省大脑能量消耗，以挽救濒死神经元，减少神经元的凋亡。此外，还有运用氧自由基清除剂、钙通道阻滞剂以及重组人促红细胞生成素进行治疗［24～25］，但这些治疗措施却对促进神经元的再生无效，HUCB-MSCs的移植治疗则能使所移植的细胞向脑组织移植并定向诱导分化为神经细胞，抑制或取代坏死和凋亡神经细胞，激发内源性神经组织修复系统，实现HIE后脑功能的康复。

2.1 HUCB-MSCs移植—有效促进神经元再生大量运用脐血移植治疗神经系统疾病的研究结果表明其治疗效果良好。Chen等［26］从尾静脉给予卒中模型的大鼠输入人的脐血，观察到移植入大鼠体内的脐血MSCs可在体内存活并迁移到损伤大脑半球，并整合到损伤的脑组织，促进损伤脑组织的恢复减轻大鼠的运动功能障碍。Borlongan等［27］在大鼠卒中模型建立后1小时即给大鼠脐血MSCs联合甘露醇移植，发现移植后第3天，在损伤的大脑的区域没有查见所移植干细胞，但移植组动物的脑组织损伤减轻以及神经行为功能较对照组有改善。他们推测是移植入体内的MSCs所释放的神经营养因子通过血脑屏障到达损伤脑区域促进了脑功能恢复。Pedro等［28］在新生大鼠缺氧缺血脑损伤后3小时，通过腹腔注射的方式将脐血MSCs移植入大鼠的体内，他们发现接受了干细胞移植的动物一周后的运动感觉反射明显改善，同时在移植后第3天，移植组的脑纹状体和皮质的坏死及凋亡的神经元数量较对照组明显减少。Xia等［29］也通过脑室内注射的途径对缺氧缺血性脑损伤(HIBI)新生大鼠进行HUBCMSCs的移植，他们发现移植组的mNSS评分较对照组的明显增高，而且脑组织的损伤也有所减轻，所移植的MSCs可以分化成为星形胶质细胞。

2.2 HUCB-MSCs移植治疗脑损伤的神经修复机制 目前对于MSCs移植对于脑损伤的神经修复和重塑的机制仍然不清楚，目前主要是倾向于以下四种机制:

2.2.1 直接细胞替代机制 所移植的干细胞向受损组织细胞分化并替代受损细胞，与周围细胞建立联系，促进神经功能恢复。Lu等［30］将HUCB-MSCs于外伤性脑损伤后24小时经鼠尾静脉注入大鼠体内，发现所移植的细胞可以向脑损伤区域迁移，并且表达神经元表面标志蛋白、微管结合蛋白-2(microtubule associated protein-2，MAP-2)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。更多的实验则是证明了只有很小一部分移植入体内的干细胞能向神经细胞分化，根本不足以达到改善神经系统功能的作用［31～33］。因此，推测直接的细胞替代可能不是主要机制。

2.2.2 参与血管的形成 有研究［32］运用人脐血MSCs移植治疗大鼠局灶性脑缺血，结果发现脑缺血灶周边区域的微血管分布较对照组密集，证明了人脐血MSCs可以促进缺血灶边缘区的微血管的增生。Chen等［33］用局灶性脑缺血大鼠的缺血脑组织提取液培养骨髓间充质干细胞，发现其表达血管内皮生长因子(vascular endothelial cell growth factor，VEGF)明显增加。Hess等［34］还发现 MSCs可以分化为血管内皮细胞，参与脑血管的重建。脑损伤后，在脑损伤区域的趋化因子SDF-1(stromal cell-derived factor-1)的表达水平增高，脐血MSCs表面有CXCR4(CXC chemokine receptor-4)的表达，可以使移植的MSCs向受损脑组织定植并且接受脐血MSCs移植后，脑组织的SDF-1的表达水平较对照组明显增高［35］，这些证据都提示所移植的MSCs对脑血管再生有重要作用。

2.2.3 提高多种神经营养因子的水平 体外实验和体内实验［36，37］均观察到MSCs可以增加多种营养因子的产生。Zhang［38］和 Chen 等［39］均发现 MSCs移植治疗脑损伤，可以提高神经生长因子(nerve growth factor，NGF)和脑源性神经营养因(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的水平，这些细胞因子可以调节细胞的增殖分化，对神经细胞起支持营养作用，减少神经损伤，并促进自体神经干细胞的分化从而恢复神经功能。

2.2.4 控制炎症反应 Vendrame等［40］的研究显示卒中的大鼠模型接受脐血MSCs移植后，体内炎症反应介质TNF-α和 IL-1β的水平比对照组低，而具有抗炎作用的IL-10的水平则较对照组高，同时减少了脾释放炎症反应细胞(如巨噬细胞)，调节脑缺氧缺血损伤之后的瀑布式的炎症反应。

3 问题与展望

将脐血MSCs移植作为临床上治疗新生儿HIE的常规手段之一，还有许多问题亟需解决。①脐血MSCs分离的效率仍然很低，且缺乏特异性手段鉴定何种细胞分化为神经元的潜能更大。②移植的时间窗和移植的途径:关于移植时间窗目前有两个观点，有人认为在缺氧缺血脑损伤之后的24～72小时是炎症反应的高峰期，脑的微环境不适于移植的MSCs的存活，应该在缺氧缺血损伤后72小时之后进行移植;另一观点则认为移植MSCs可以控制损伤脑组织炎症介质释放，减少脑损伤程度，应该尽早进行MSCs移植。实验中运用脑室内注射、腹膜内注射，以及经大鼠尾静脉注射的途径均有治疗效果，但是何种移植途径治疗效果更好目前仍不确定。③促进神经修复的机制:脐血MSCs移植后可以从损伤部位观察到MSCs分化的神经细胞，且大鼠的症状有所缓解，但其作用的具体机制，以及何种机制起着主要作用，这都需要进一步的研究。

脐血MSCs目前已初步应用于临床。在国内外儿科领域，有学者［41，42］运用脐血 MSCs治疗脑性瘫痪患儿，结果显示脐血MSCs移植能有效的改善脑瘫患儿的运动功能。有个案报道［43］运用脐血MSCs治疗1例儿童型脊肌萎缩症之后，该患儿的肌力提高，神经功能改善明显。随着研究的进一步深入，脐血MSCs移植将有望成为新生儿HIE的常规治疗方法之一，给危重HIE患儿的康复带来希望。

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