食用菌液体菌种制作技术

阮时珍 阮晓东 李月桂 阮周希 黄巧珍 陈 强

(1.厦门市食用菌研发中心,福建 厦门 361100;2.福建农林大学食品科学系,福州 350002;3.福建省宁德市华林微生物技术研究所,福建 宁德 352100;4.江西省赣州市创新生物科技研究院,江西 赣州 342100)

食用菌液体深层发酵技术属于系统生物工程技术,将微生物应用于工业生产,始于19世纪末20世纪初,而逐步应用于食用菌领域,则源于1948年美国H.Humfeld等科学家对蘑菇深层发酵技术的成功探索。在我国,最早于1960年由上海植物生理研究所陈美聿等进行香菇深层发酵研究。上世纪80年代以来,关于食用菌生产的各种发酵设备研制的报道日益增多。目前液体菌种在国内已应用到杏鲍菇工厂化栽培上,先后在辽宁、北京、上海、广州、福建、江苏等地应用推广,效果较好。

液体菌种生产技术之所以被人们关注,是因为它与传统食用菌子实体或菌种的生产方法相比,具有明显的优越性。在液体深层培养过程中,菌丝体能在发酵罐内处于最适温度、酸碱度、氧气和碳氮比的条件下生长,呼吸产生的废气能及时排出,新陈代谢旺盛,菌丝生长迅速,在3～5天内就能获得大量可用于生产的液体菌种。液体菌种接入固体培养基培养,具有流动快、分散性好、萌发迅速、菌丝生长快、覆盖料面早等特点,可降低杂菌污染几率,缩短生产周期,提高生产效益。这是固体菌种所不能比拟的。

1 发酵罐的系统组成

以100～200 L发酵罐为例,发酵系统由发酵罐、空气过滤系统、电控系统等组成。发酵罐体分内、外两层,外层电加热,兼做蒸汽发生器和降温用;内层做发酵罐,装有提升管通气道。空气过滤系统由压缩机、减压阀、油水分离器、粗过滤、精过滤等组成。电控系统包括温控仪、温度探头、时间继电器等组件。

2 主要技术参数

2.1 液体菌种发酵罐 设计压力为0.25 MPa,灭菌压力≤0.15 MPa,灭菌温度121～125℃。培养过程中,培养器压力0.03～0.05 MPa,夹层冷却水压力≤0.13 MPa。

2.2 空气过滤系统 气泵转速为1 400 r/min,排气量125 L/min,滤芯的过滤精度为0.01 UM,过滤效率99.99%,耐蒸汽125±2℃,200 h。

发酵温度根据品种不同,可自行设定,然后由温控器自控。

3 使用前的技术准备

使用前首先要检查电源、电器、温度探头、仪表系统是否正常;检查压缩机是否正常运转;开动压缩机,用0.15 MPa的压力,检查过滤器、管路、阀门、发酵罐的密封性能是否良好。发酵罐设备属机电一体设备,操作人员使用前必须进行必要的培训,以熟悉整个系统的工作原理、设备的性能,以及管路阀门的操作程序等。

4 发酵罐的使用与工艺流程

生产操作的程序:罐清洗检查→培养基制备→上料→培养基灭菌→降温→接种。

4.1 发酵罐的清洗检查 发酵罐在每次使用后或再次使用前都必须对罐内进行彻底的清洗。方法:用自来水管冲洗罐的内壁,并彻底清除提升管通气道上的异物。另外要检查各个阀门、加热器、温度计保护套、控制柜和气泵是否正常,如有故障,需及时排除。

正常情况下,上一批生产完毕后,一般只需对罐进行清洗,即可进入下一批生产,而不需要空消。但遇以下情况时则需要对罐进行空消:①新罐初次使用;②上一罐感染杂菌;③更换生产品;④罐长时间不用。

空消的方法:关闭各部的阀门,加水至视镜中线,启动加热器加热,微开排气阀加热到 120～126℃维持30～40 min,然后放出煮罐里的水。

4.2 培养基制作 马铃薯10%、麸皮3%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.075%、红糖1%、蛋白胨0.2%、消泡剂0.035%。根据不同的品种采用不同的培养基配方,在没有确定最佳配方时,多数品种都可以用本配方。

马铃薯挖芽、去皮洗净后,切成0.2～0.4 cm的片和麸皮同放一起,用直径24～30 cm的不锈钢锅 (或铝锅)分批煮至马铃薯酥而不烂时,用6～8层的纱布过滤取液,放入较大的塑料桶后,再煮一锅红糖和其他物料,一起搅拌熔化即可。要注意用于制作培养基的器具要单独使用,不要沾染油污。

把制作好的培养基放入罐中后,加入自来水调整料液至标准水位线,进行灭菌。

4.3 培养基和精过滤器的灭菌 设定灭菌温度在121～126℃,打开排气阀,按启动开关,两个加热管开始加热工作,于温度达100℃时,排除冷空气,有大量蒸气排出时,方可关闭排气阀。于温度达到126℃,压力为0.15 MPa时,要立即微开排气阀,并开始计时30～40 min。气路和精过滤器要同时用饱和蒸汽进行灭菌,消除所有死角和杂菌,确保系统处于无菌状态。

4.4 降温与冷却 灭菌结束后,关闭所有的阀门,设定培养温度为22～26℃,并应立即通入冷水降温,于压力降至0.03～0.05 MPa时,开始通气,调整发酵罐内压力为0.03～0.05MPa,至温度降为22～26℃时开始罐内接种。

4.5 发酵罐内接种 准备好经提前培养的300～500 mL的三角抽滤瓶装液体种,先用95%的酒精火圈封住发酵罐上的接种口,逐渐打开接种阀门,待罐内压力降至0时,立即把准备好的菌种通过滤嘴快速倒入罐内,接种过程要在火焰保护下进行,关闭接种阀,调整罐内的压力到0.03～0.05 MPa,并检查发酵罐、温度和空气流量。

4.6 发菌培养 依据不同品种设定不同培养温度,一般为22～26℃,空气流量调至1.2～2.0 m3/h,罐内压力在0.03～0.05 MPa之间。

培养期间不需专人管理,自接种24 h以后,每隔12 h可自接种口取样一次,观察菌种萌发和生长情况。通常观测以下几个指标:①菌液颜色澄清度,正常菌液颜色纯正,虽有淡黄、橙黄、浅棕色等,但不浑浊;②菌液的气味,正常的菌液有一种香甜味,随着时间延长味道越来越淡;③菌液中菌球数量的增长情况,从无到有小菌球逐渐增多变大。一般品种整个培养周期为3～5天。菌种发酵终点的判断依据是:①菌液取样静置5 min,菌球占整个菌液的80%～90%。菌球与菌液界线分明,周边毛刺明显,菌丝活力强。②液体的香甜味前期较浓,随着培养时间的延长会越来越淡,取而代之的是菌丝的特有味道。③菌液的颜色变浅,澄清透明,营养耗殆。

4.7 栽培袋接种 于液体菌种达到质量要求后便可进行接种。具体做法是:将接种管和接种枪接好,用8～10层纱布包好接种管及接种枪头,在121～126℃的条件下灭菌40 min。在火焰的保护下将接种管装到接种口上。调整发酵罐内的压力至0.03～0.05 MPa后,打开接种阀开始在接种室的超净台前进行接种。3个人配合操作较理想,其中一人搬运筐 (菌袋),一人开袋口,一人用注枪接种,要求孔内和料面都布满菌种,每袋接种量为10～15 mL。

5 液体菌种质量检查项目

5.1 菌液颜色和气味的检查 正常情况下,菌液初期略显浑浊。随着发酵的进行菌液逐渐变为清澈,颜色越来越淡;若有污染发生,菌液始终处于浑浊状态,菌球与菌液的界限不明显,且发酵液颜色出现异常变化。若污染杂菌或菌种质量不好,菌液会有酸味、臭味、酒味或其他异常的气味。因而在菌种培养过程中,工作人员要经常闻一闻气口排出的气味是否正常。

6.2 菌种纯度和状态的检查 接种24 h后,需每隔12 h从放料口取样一次,进行纯度检查,经过染色后,检查有无杂菌,并通过染色的深浅判断菌丝体的活力。正常的菌丝呈团状,比较密集,边缘有树根状分支;染有霉菌的,菌丝相对粗壮,且不成团:染有细菌的,菌丝较短且纤细。为了进一步检查菌液是否有污染,可以采用准确度更高的方法,即将样品接种于肉汤培养基,于恒温下培养,看是否有杂菌菌落长出。

放料接菌袋之前应提前取样检查一下菌种的状态,正常菌丝应呈球状,分布较均匀,稍有粘稠,悬浮状态较好,静置5 min,菌球既不上浮也不下沉,菌液澄清透明,菌球与菌液界限明显。