生物材料中化学毒物快速鉴定技术研究*

河南省职业病防治研究院 肖庆锋 秦文华

生物材料中化学毒物快速鉴定技术研究*

河南省职业病防治研究院 肖庆锋 秦文华

生物样品检测，即检测人体内生物材料中化学物质或其代谢产物的含量，常用来评价人体接触化学物质的程度以及可能造成的健康影响。对职业人群的生物样品检测，可以用来长期监测职业环境中有害因素的浓度。生物样品的检测与环境监测相辅相成，为评价职业有害因素对人体的危害提供科学依据。对生物监测指标的检测，尤其是对健康效应指标的检测，有助于发现和确定易感人群，筛检不宜从事某项工种的人群，从而减少职业病的发生。生物样品的检验能较为准确地测量劳动者体内有害物质的含量，在职业流行病学调查和外源性化学物危险度评价中经常被采用。本文，笔者利用原子吸收分光光度计、气相色谱仪、分光光度计和电化学分析仪等仪器，结合捕集阱顶空预分离技术，系统研究了一些化学毒物的鉴定技术，为评价人体接触化学毒物的程度与可能造成的健康影响提供必要的检测手段，并且为化学中毒应急救治提供依据。

一、生物样品中无机化学毒物快速鉴定技术研究

1.原子荧光测定法测定尿液、血液中锑的含量。

（1）测定原理。将样品经湿法消解后，在酸性条件下，加入硫脲和抗坏血酸，使五价锑预还原为三价锑，再加入硼氢化钠或硼氢化钾使三价锑还原生成锑化氢，将氩气载入石英原子化器中，将锑化氢中的锑分解为原子态锑。原子态锑在锑空心阴极灯的发射光激发下产生原子荧光，原子荧光发光强度在固定条件下与被测液中的锑浓度成正比，因此可以通过检测原子荧光发光强度来计算血液中锑的浓度。

（2）测定方法。取1 mL样品放入锥形瓶中，加入3 mL H2O2和4.5 mL HNO3（即H2O2与HNO3体积比为2∶3），放置3 h，用恒热电热板在100℃时加热处理30 min，再在110℃时加热赶酸，直至近干，冷却后转移至5 mL比色管中，同时加入2.5 mL质量分数为10%的HCl，用质量浓度为10 g/L的抗坏血酸-硫脲混合液定容至5 mL。实验过程中比较酸度、硼氢化钾浓度、载气及屏蔽气流速等因素对测定结果的影响。样品处理选用H2O2和HNO3的混合液作为消解试剂，所得结果精密度符合要求，且整个方法重现性好，取样量少，灵敏度高，操作简单、快速，基体干扰少，测定仪器价格低，适合于职业接触或中毒人群尿液、血液中锑的含量分析。

2.微分电位溶出分析法测定生物材料中镓的含量。将待测样品置于10 mL的比色管中，分别加入适量的镓标准溶液、0.2 mL质量分数为15%的KCl溶液、1 mL质量分数为0.15%的甲酸溶液和150 μg Hg2+，定容至5 mL，放入微分电位仪测定镓含量。该方法不需要特殊试剂，样品处理过程简单，灵敏度高，可快速测定，回收率能够控制在90%～111%。但是要消除溶液中各种金属离子的干扰，消除方法方法如下。

（1）消除Zn2+的干扰。首先将富集电位调到-1.2 V，搅拌富集80 s；然后将电位调到-1.0 V，静止富集30 s，使锌从汞膜中溶出，从而减少互化物。

（2）消除Cu2+的干扰。选择质量浓度为1 mg/L的锗，以阻止铜与镓的互化物的形成。

（3）消除Fe3+的干扰。待样品消化完全后，取1mL质量分数为20%的盐酸羟胺放入三角瓶中，在电热板上加热煮沸5 min，即可把Fe3+还原为Fe2+。

3.石墨炉原子吸收法测定尿液、血液中铊的含量。

（1）尿液中铊含量的测定。先将尿样用质量分数为1%的HNO3酸化，再以PdCl2为基体改进剂消除干扰，然后使用石墨炉原子吸收法直接测定尿样中铊的含量。该方法质量浓度检出限为0.56 μg/L，加标回收率为98.8%～101.5%，该方法简单快速，精密度和稳定性好，符合尿液中铊的测定要求。

（2）血液中铊含量的测定。由于血液的前处理过程比较复杂，且铊为易挥发元素，容易在前处理过程中造成铊损失，所以要先用质量分数为5%的HNO3酸化，再以质量浓度为1 g/L的钒为基体改进剂消除干扰，放入微分电位仪测定全血中的铊含量，该方法操作简便，灵敏度较高，符合血液中铊检测的要求。

4.微分电位溶出分析法测定脏器（肝、肾、肺）中的铊。取样品1 g，倒入聚四氟乙烯消化罐中，再加入3 mL消化液，在170℃时消化12 h，用物质的量浓度为5 mol/L的NaOH将pH值调为7，并定容至100 mL。取上述溶液1 mL倒入50 mL小烧杯中，加入物质的量浓度为0.3 mol/L的醋酸和物质的量浓度为0.25 mol/L的醋酸钾缓冲溶液各5 mL、物质的量浓度为0.1 mol/L的EDTA2.5 mL和水16.5 mL，放入电位溶出分析法仪测定，用标准加入法定量（铊的溶出电位为-0.7 V），该方法灵敏度、准确度高。

5.氢化物原子荧光测定法测定尿液中铅的含量。将1.0 mL尿样倒入浓HNO3荡洗过的100 mL三角瓶中，加2 mL混合酸溶液（混合酸溶液中HNO3与HClO3体积比为3∶1），在电热板上消化至无色近干后取下。加5.0 mL去离子水，摇匀后取2.0 mL置于一次性塑料管中，再加入0.4 mL混合溶液（由质量浓度为80 g/L的铁氰化钾和质量浓度为4 g/L的草酸、质量分数为8%的HCl组成）和1.6 mL去离子水，摇匀，放入原子荧光光度计测定。该方法质量浓度的检出限为0.2 μg/L，相对标准偏差为2.7%。

6.涂镧石墨管-石墨炉原子吸收光谱测定法测定尿液中的微量钡。先将热解平台石墨管放入质量分数为5.4%的硝酸镧溶液中浸泡24 h，再用超声处理15 min，以赶尽石墨管表面的气泡，使涂层均匀。自然风干后，放入烘箱中，在120℃条件下干燥2 h，把石墨管两端及外面用纸擦干净，以防止石墨管污染石墨锥。将其放入石墨炉中，在120℃条件下加热30 s，900℃条件下加热30 s，2 000℃条件下加热10 s，2 600℃条件下加热10 s，连续加热3次，加热时氩气流速为250 mL/min。尿样用100+2比例（尿样与浓酸的体积比为100∶2）的浓酸消化，将有机物质破坏，使钡以离子形式存在于待测液中，有利于钡的原子化。该方法以质量分数为40%的硝酸铵和质量分数为6%的硝酸镁为混合基体改进剂，改善尿样中的基体，可以有效消除背景吸收，用质量分数为5.4%的硝酸镧涂层平台石墨管，能有效抑制碳化钡的生成，此外，涂层石墨管也避免了高温石墨管本身在可见区的强辐射，有利于尿样中微量钡的测定。该测定方法简便，准确度高。

7.石墨炉原子吸收法直接测尿液、血清中铬的含量。

（1）尿液中铬含量的测定。尿样按100+2的比例（尿样和浓HNO3的体积比为100∶2）加入浓HNO3消化，采用质量分数为4%的NH4NO3为基体改进剂，用石墨炉原子吸收法测定尿液中铬的含量。该方法用NH4NO3为基体改进剂，改善尿样基体，减少背景干扰，样品不需繁琐的预处理，减少了样品污染和损失的机会。该方法简便、快速，适用于大批量的尿样中铬含量的测定，该方法测定的精密度和准确度较好，质量浓度检出限为0.12 μg/L。

（2）血清中铬含量的测定。将血清用浓HNO3酸化，以质量浓度为4 mg/L的硝酸镁作为基体改进剂，放入石墨炉原子吸收光谱仪测定血清中铬的含量。该方法样品不需进行复杂的化学前处理即可测定，克服了生物样品背景吸收过大的缺点，减少了污染，简化了操作过程，降低了误差，大大缩短了分析时间，且质量浓度检出限低，经方法学研究和对若干份混合血清样品测定，均取得了满意的结果。

二、生物样品中有机化学毒物快速鉴定技术研究

1.带捕集阱顶空-气相色谱法技术（FID）应用研究。采用正交设计方法，以四氯乙烯为研究对象，探讨用捕集阱顶空-气相色谱法测定氯代烃的最佳条件，包括测定氯代烃时所采用的温度、时间、压强等检测条件，并对这些条件进行优化，得到了使用顶空仪器的最佳条件：取样针温度100℃，传输线温度100℃，炉温80℃，保温时间30.0 min，干吹时间2.5 min，捕集阱保持时间6.0 min，解析时间1.1 min，加压时间1 min，释压时间0.8 min，色谱柱压强275.79 kPa，瓶压强206.84 kPa，解吸压强103.42 kPa。所得最佳条件可应用于生物样品中氯代烃的测定。

2.带捕集阱顶空-气相色谱法测定血液中四氯乙烯的含量。用5 mL肝素钠真空抗凝管采集静脉血5 mL，摇匀，抽取2 mL肝素钠抗凝全血于顶空样品瓶中，注入3 mL的蒸馏水，立即密封好顶空瓶口，进行测定。用带捕集阱顶空仪进样，经气相色谱仪（Elite-5MS毛细管柱）分离后使用氢火焰离子化检测器检测，峰形分离较为理想。温度超过70℃时，血液会凝固，因此顶空仪炉温设为65℃，以减少传统分析方法中对血液的复杂前处理，保证结果的准确性。该方法操作简便，灵敏度高，可对高浓度四氯乙烯接触者的血液中四氯乙烯的浓度进行检测。

3.带捕集阱顶空-气相色谱电子捕获（ECD）法测定血液中四氯乙烯的含量。样品经带捕集阱顶空仪前处理后进入气相色谱仪，经Elite-1701毛细管柱分离后使用电子捕获检测器测定四氯乙烯含量。该方法不仅降低了血液中碳氢有机物质的干扰，而且提高了灵敏度，ECD检测器信号强度比FID检测器提高了大约30倍，校准曲线线性范围为0～160 μg/L，线性相关系数为0.999 9，质量浓度检出限达到0.9 μg/L，对高、中、低浓度样品进行测定，精密度值的相对标准偏差分别为2.15%，4.46%，4.77%，回收率为90%～110%。该方法适用于对低浓度四氯乙烯接触者以及正常人群血液中四氯乙烯浓度的检测，而且操作方便，适宜于做大批样本的测定。

4.带捕集阱顶空-气相色谱法测定血液中挥发性氯代烃的含量。该方法以三氯乙烯为研究对象，探讨三氯乙烯测定条件和方法的线性关系、质量浓度检出限、回收率及稳定性。校准曲线线性范围为0～80μg/L，线性相关系数为0.999 2，质量浓度检出限为0.5 μg/L。在线性范围内，分别对高、中、低浓度样品进行测定，精密度值的相对标准偏差分别为4.05%，7.28%，7.44%，回收率为96.83%～105.00%。该方法同时可用于血液中三氯甲烷、四氯化碳、二氯乙烷、三氯乙烯和四氯乙烯等挥发性氯代烃的测定。

5.血清中毒鼠强含量的快速化学检测方法研究。以硫酸为分解剂，变色酸为显色剂，测定血清中的微量毒鼠强。该方法灵敏度高，质量浓度检测下限达到0.1 mg/L，检测成本低，实用性强，实验操作简便、快捷。

6.分光光度法快速测定尿液中百草枯的含量。先以酸沉淀法或滤纸过滤法消除蛋白质的干扰，再通过百草枯与连二亚硫酸钠反应生成的有色物质来定性。定量检测常用方法有两种。

（1）方法一。用塑料试管取尿液4 mL，加入物质的量浓度为1 mol/L的HCl溶液酸化，摇匀，离心分离15 min（离心机转速为3 500 r/min）后，取上层清液2.5 mL加人另一个塑料试管，加入0.5 mL物质的量浓度为1 mol/L NaOH溶液，然后加入2 mLNH4C1-NH3溶液（pH=10.3），最后加入4滴质量分数为10%的连二亚硫酸钠，倒入比色皿比色，比色时吸收波长为395 nm。通过工作曲线紫外光度法来定量，获得了满意的结果。

（2）方法二。取2.5 mL样品，加入2.5 mL水、0.3 g无水碳酸钠和0.1 g碳酸氢钠，摇匀，用慢速定量滤纸过滤，滤液倒入比色皿比色，比色时吸收波长为396 nm，所得吸光度为尿样的空白吸光度A0；将比色皿中的溶液倒回原试管中，加入0.05 g连二亚硫酸钠，摇匀，再于396 nm比色，所得吸光度为样品吸光度A样0（即A样-A0），通过线性回归方程计算得到的值乘以2即为尿中百草枯的浓度。

三、全自动微量元素分析仪

笔者所在项目组研发的全自动微量元素分析仪以电化学原理为测定依据，将测试杯转盘装置中的转盘安装在机架上并通过传动机构与转盘电机连接，转盘在垂直平面内转动，其圆周体壁均匀安装一定数量的固定套，每一个固定套中安装一个测试杯，二者为转动配合，并在测试杯下部套装固定齿轮，该齿轮和测试杯转动电机的齿轮相连接。自动微量元素分析仪包含测试杯转盘装置、电极装置、样品盘、自动加样装置、底液或活化液加液装置、清洗装置及计算机控制装置。该发明使用电子技术控制分析仪，各个机械装置自动运转，具有自动加样、自动加活化液、自动测量、自动记录、自动清洗测试杯和自动干燥测试杯等功能，检测过程实现了自动化，并且具有设计新颖、测量精度高等优点。

本文，笔者所研究的各种方法和技术不但适用于职业中毒或自杀投毒等中毒患者的诊断，还可以为化学中毒应急救治提供依据，也可以用于职业人群的健康体检。所研发的全自动微量元素分析仪可以广泛应用于水质分析、环境监测、临床检验、保健普查、疾病控制等领域，如环保部门对废水、废气、废物中的微量元素的监测，卫生部门对生物材料、生活用品、饮用水、食品等物质中微量元素的检测等。

河南省科技攻关计划资助项目（0124170401）。