Toll样受体4与动脉粥样硬化

张溢华 综述，陈礼刚审校

（泸州医学院附属第一医院神经外科，四川泸州 646000）

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是脑血管疾病、冠脉疾病、周围动脉疾病等诸多血管性疾病的病理基础，心脑血管疾病的发生率随着AS发病率的增高，而不断增加，人类身体健康受到严重威胁。研究表明，AS是一种脂质介导的慢性炎症性疾病［1］，以血管壁内脂质沉积、炎症细胞聚集为特征［2］，免疫反应贯穿于AS的始终。Toll样受体（toll like receptors，TLR）尤其是Toll样受体4（TLR4）作为一类介导非特异性免疫反应的跨膜信号转导受体蛋白，能够识别多种病原相关的分子模式（PAMPs），并能调控胆固醇的代谢、细胞凋亡、斑块的稳定性、炎症和免疫反应以及血管重塑等病理过程，在动脉粥样硬化的发生发展中的作用极其重要，是最近几年研究较多的模式识别受体，其在免疫反应中作用突出。TLR4能识别PAMPs并激活炎症细胞。TLR4既可识别外源性配体－革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）同时也能识别动脉损伤过程中表达的内源性配体。诸多研究表明，TLR与越来越多的临床疾病关系密切［3］，在AS的发生、发展进程中，TLR4的作用至关重要，本文就TLR4的结构功能、信号转导通路与AS之间的相关性作一综述。

1 TLR4的概述

TLR4是模式识别受体中研究最多的人TLR，主要表达于树突状细胞和巨噬细胞等免疫细胞表面，在免疫应答和炎症反应中起重要作用。TLR4属于Ⅰ型跨膜蛋白，由24个亮氨酸重复序列组成的细胞外区、跨膜区和细胞内的序列保守区3个部分组成。TLR4位于9q32－33，cDNA长度有3 811bp，包含879个氨基酸，多表达于T淋巴细胞、B淋巴细胞、白细胞、单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、小肠上皮细胞、表皮微血管、脐静脉内皮细胞、人成龈牙纤维细胞、人子宫颈平滑肌细胞、呼吸气道上皮细胞和心肌细胞等［4］。TLR4作为模式识别受体，通过胞外区的亮氨酸重复序列可使不同的PAMPs被识别。其既可识别外源性配体－革兰阴性细菌细胞壁成分LPS，同样也可识别动脉损伤过程中表达较多的内源性配体，从而介导机体炎症反应过程。

2 TLR4如何转导信号通路

2.1 细胞外部分的信号通路转导 在TLR4介导的细胞信号转导过程中，LPS结合蛋白（LPS－binding protein，LBP）首先将LPS从细菌外膜上转移下来，并与其脂质A结合，形成LPSLBP复合物，该复合物再与可溶性CD14（sCD14）结合，形成由这三者构成的复合物。再将复合物中的LPS传递给膜结合CD14（mCD14），并由mCD14将LPS转运并锚定于由TLR4和髓样分化蛋白－2（myeloid differentiation protein，MD－2）构成的受体复合物［5］，LPS结合 MD－2后，通过TLR4的细胞外富含亮氨酸的重复序列介导TLR4的聚合，进而触发TLR4的信号转导。同时，LBP和CD14将LPS传至高密度脂蛋白颗粒，促进其失活。

2.2 细胞内部分的信号通路转导 髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）是TLR4信号通路中重要的接头蛋白，因此，可以根据TLR4的信号转导过程是否有MyD88的参与将该信号通路分为MyD88依赖性（早期反应）和非依赖性（迟发反应）信号通路两种［6］。前者活化丝裂原激活的蛋白激（mitogen－activated protein kinase，MAPK）和核因子－κB（nuclear factor kappa B，NF－κB）信号通路，后者活化 NF－κB和干扰素调节因子－3（IFN－regulated factor－3，IRF3）信号通路。通过上述信号途径TLR4诱导炎症细胞释放炎症介质来介导炎症反应；同样TLR4也通过激活树突状细胞促进抗原递呈，介导先天性免疫转化为获得性免疫。

2.2.1 MyD88依赖性信号转导通路 MyD88由氨基端死亡结构域（death domain，DD）、羧基端TIR结构域和一个短的连接序列组成。在MyD88依赖的信号通路转导过程中，MyD88通过TIR结构域与TLR4的TIR相结合、通过DD结构域与IRAK（IL－1Rassociated kinase，IRAK）相结合，导致其自身磷酸化［7］，从而使肿瘤坏死因子相关受体因子6（tumor necrosis factor associated receptor 6，TRAF6）能与磷酸化的IRAK4－IRAK1结合，形成复合物。随后，IRAK1－TRAF6从TLR4上分离出来，再去激活其他的复合物，包括转化生长因子β活化激酶（transforming growth factorβactivated kinase，TAK1）、TAK1结合蛋白1（TAB1）、TAK1结合蛋白2／3（TAB 2／3），并使其磷酸化。TAK1就能使抑制性的 NF－κB（inhibitor of nuclear factor－κB，I－κB）激酶活化，形成活化的I－κB激酶（IKK）复合物IKKα、IKKβ、IKKγ，增加I－κB的降解，从而使细胞核内的NF－κB水平升高，导致细胞内不同促炎症反应基因的表达增加。通过上述信号转导途径，TLR4介导转录因子的激活，诱导转录靶基因，并介导早期的非特异性免疫反应。

2.2.2 MyD88非依赖性信号转导通路 MyD88非依赖性信号转导通路为IRF3和NF－κB的迟发激活反应。TLR4的激活引起TIR的接头蛋白分子（TRIF，也叫TICAM－1）结合了细胞内的TIR结构域，TRIF再激活干扰素调节蛋白3（IRF3），IRF3与干扰素激活反应元件连接，使得靶基因的转录被激活。有实验证明，在TRAF缺乏的细胞中，不能激活Ⅰ型类干扰素，这说明这条信号转导通路可能是由TRAF介导的。且这一通路也能诱导干扰素诱导蛋白－10、糖皮质激素衰减反应基因－16、干扰素调节基因－1表达和DC的成熟［8］。

3 TLR4与AS的关联性

AS是一种特别的慢性炎症性疾病，以血管壁内炎症细胞及脂质聚集为特征［9］，其进程可被分为若干不同阶段，每一个阶段都有不同的细胞分子学特征［10］，而由TLR4介导的免疫反应却贯穿于AS的始终。TLR4胞内段结构与IL－1受体类似，被称之为 TLR 结构域（Toll／IL－1receptor homologous region，TIR），负责受体活化后的信号转导。在对人及小鼠动脉粥样硬化模型的组织切片进行免疫组化结果发现［11］，TLR4在粥样斑块组织特别是在脂质丰富、巨噬细胞浸润的部位显著表达，并与巨噬细胞共表达。另有研究表明，AS患者的斑块中TLR4表达增高，且主要表达于巨噬细胞和血管内皮细胞；在载脂蛋白E基因缺陷小鼠AS模型中TLR4基因缺陷斑块组成改变，降低斑块中巨噬细胞和脂质的成分，并明显降低促炎因子的表达［12－13］。巨噬细胞中激活的TLR4能引起一系列信号级联反应，诱发炎症因子、蛋白酶表达，进一步促进动脉粥样硬化形成。

3.1 TLR4在AS中的内源性配体 目前已经发现多种TLR4的内源性配体，例如：脂多糖、热休克蛋白、纤连蛋白－EDA、硫酸类肝素、透明质酸、纤维蛋白原、mmLDL、泰素、甘露糖醛酸、包膜蛋白、中性白细胞弹性蛋白酶、肺炎衣原体HSP60等，且已经被证明部分受体在AS的形成中作用至关重要。纤连蛋白是一种分子量较大的细胞外基质糖蛋白，作为细胞外基质的结合部位，它能调节细胞外基质的组成。在AS患者的动脉内膜可见纤连蛋白及其变异体，包含额外的结构域A（纤连蛋白－EDA），纤连蛋白－EDA在非AS患者动脉中是不存在的［14］。Tan等［15］证实小鼠纤连蛋白－EDA的缺失可以通过降低致AS的遗传背景来减少AS的发生，这个过程可能是通过降低巨噬细胞对LDL的摄取来实现的。在ApoE敲出的小鼠动脉损害部位，其纤连蛋白－EDA的mRNA表达水平升高；另外，血清中EDA的水平也同样地升高［16］。在细胞的原代培养中发现纤连蛋白－EDA不但能激活TLR4，而且还能诱导TLR4的表达［17］。这些研究均说明纤连蛋白－EDA可能是TLR4致AS的内源性配体，参与TLR4的信号转导通路。

脂类对于AS的发生发展中起很大作用，如内皮下脂质的沉积、巨噬细胞对脂质的摄取以及泡沫细胞的形成，在脂纹的形成过程中至关重要。高胆固醇患者巨噬细胞膜表面的LDL受体水平降低，这提示脂质在被巨噬细胞吞噬之前已经发生氧化。Xu等［18］研究发现在单核－巨噬细胞中，与天然的LDL相比氧化型LDL（oxidized LDL，oxLDL）能使TLR4mRNA的表达水平增加。然而，oxLDL能否结合并激活TLR4还未被证实。相反，在树突状细胞中TLR4活化后炎症因子的产生却被抑制，这可能是由于I－κB进入细胞核内导致的［19］。oxLDL的早期形式mmLDL能介导肌动蛋白的集合及巨噬细胞的扩散，这依赖于TLR4信号通路的激活。另外，Miller等发现mmLDL诱导巨噬细胞产生炎症介质有一部分依赖于TLR4。直到今天，在AS形成进程中，氧化型脂类通过TLR4信号通路发挥作用的确切作用是有争议的。

有多数热休克蛋白（heat shock protein，HSP）已经被证实在AS的过程中起重要作用。HSP属于分子监控蛋白类，在蛋白质－蛋白质相互作用中比较关键。HSP在多种细胞类型中均有表达，特别是在处于应激状态的细胞中表达较高，例如炎症、高热、缺氧等。在ApoE基因敲出、高胆固醇饮食饲养的小鼠与ApoE基因未敲出、正常饮食小鼠相比，前者动脉粥样斑块中HSP 60和 HSP70表达增高［17］，在稳定的 AS斑块中HSPmRNA的水平有所衰减［20］。HSP作为TLR4的内源性配体，能够通过TLR4影响AS中产生发生和发展。然而，到目前为止对于HSP60和HSP70是如何通过TLR4在AS中产生发病机制的研究还不清楚。

虽然许多研究均表明，TLR4的内源性配体通过激活TLR4影响AS的发生和发展，但是其在影响AS发生发展和斑块的稳定性方面的分子机制不详。

3.2 TLR4与AS Michelsen等［21］是最早提出TLR4与AS形成是有直接联系的。在这个研究中，TLR4／ApoE都被敲出的小鼠比只有ApoE被敲出的小鼠AS的发生率小，其内膜损伤程度也比MyD88／ApoE都被敲出的轻。在TLR4／ApoE和MyD88／ApoE都被敲出的小鼠中，其抗AS的作用与胆固醇水平几乎没有关联。同时，在TLR4／ApoE和 MyD88／ApoE都被敲出的小鼠AS斑块中的脂质和巨噬细胞也显著降低，这说明TLR4信号通路在动脉粥样斑块的发生发展中和斑块稳定性中至关重要。

外向性的重构导致血管壁的增生是AS进程中的代偿性机制。在外向性重构过程中细胞产生基质金属蛋白酶，它能够削减粥样斑块的稳定性，导致其不稳定性增加容易发生损伤［22］。Hollestelle等TLR4在血管外向性重构中的作用，他们建立了一个结扎对此颈动脉的小鼠动物模型，实验表明，血管的外向性重构依赖于TLR4，在TLR4缺乏的小鼠模型没有出现血管的外向性重构。这些证据均表明，TLR4在血管外向性重构的代偿机制和基质金属蛋白酶的活化中都发挥重要的作用，使粥样斑块的不稳定性增加。

血管平滑肌细胞是动脉粥样斑块中重要的产生基质的细胞，所以它的凋亡将导致细胞外基质的产生减少。TLR4通过Fas相关死亡结构域依赖的途径来促进血管平滑肌细胞的凋亡［23］。最近，Ishikawa等［24］研究发现 TLR4在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）、稳定性心绞痛（stable angina，SA）等住院患者破裂的粥样斑块中有所表达。与无缺血性疾病的患者相比，AMI和SA患者都存在全身性的TLR4mRNA和蛋白质表达水平增高［25］。这些都说明TLR4在动脉粥样斑块的形成中发挥重要作用。

4 小结与展望

AS是一种脂质介导的慢性炎症性疾病，大量的证据表明TLR4是AS和非特异性免疫之间的重要介质。TLR4广泛地表达与不同的细胞类型，与AS的发病机理和促AS的配体结合有关。TLR4能激活NF－κB转录因子和促炎性蛋白，进一步促进炎症反应的发生和动脉粥样斑块的不稳定性增加。通过对TLR4结构功能、信号通路及其与AS的关联性研究有助于加强对AS的了解，更明确揭示AS的实质，为防治AS提供新靶点。

［1］ Wijnand K，Den D，Caroline C，et al.Toll like receptor 4in atherosclerosis and plaque destabilization［J］.Atherosclerosis，2010，209（2）：314－320.

［2］ Hansson GK.Inflammation，atherosclerosis，and coronary artery disease［J］.New Engl J Med，2005，352（16）：685－695.

［3］ 嵇武.Toll样受体与临床疾病关系的研究进展［J］.中国误诊学杂志，2007，16（7）：3709－3711.

［4］ Zhang X，Shan P，Qureshi S，et al.TLR4deficiency confers susceptibility to ethal oxidant lung injury［J］.J Immunol，2005，175（8）：4834－4838.

［5］ Palsson－McDermott EM，O′Neill LA.Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor，Toll－like receptor－4［J］.Immunology，2004，113（2）：532162.

［6］ 杨玉荣，余锐萍，梁宏德.Toll－NF－kB信号途径及其介导的功能［J］.细胞生物学杂志，2007，29（4）：483－486.

［7］ Li T，Hu J，Thomas JA，et al.Differential induction of apoptosis by LPS and taxol in monocytic cells［J］.Mol Immunol，2005，42（9）：1049－1055.

［8］ 张乐逸，张宇飞，嵇武.Toll样受体4的研究进展和临床意义［J］.肠外与肠内营养，2009，16（2）：123－126.

［9］ Hansson GK.Inflammation，atherosclerosis，and coronary artery disease ［J］.New Engl J Med，2005，352（16）：1 685－1695.

［10］耿小勇，陈一文.Toll样受体4在动脉粥样硬化中的作用研究进展［J］.中国动脉硬化杂志，2008，16（1）：78－80.

［11］Xu XH，Shah PK，Faure E.Toll－like receptor－4is expressed by macrophages in murine and human lipid－rich atherosclerotic plaques and upregulated by oxidized LDL［J］.Circulation，2001，104（10）：3103－3108.

［12］Punturieri A，Alviani RS，Polak T，et al.Specific engagement of TLR4or TLR3does not lead to IFN－beta media－ted innate signal amplification and STAT1phosphorylation in resident mur ine alveolar macrophages［J］.Immunol，2004，173（2）：1033－1042.

［13］Bjorkbacka H，Kunjathoor VV，Moore KJ，et al.Reduced atherosclerosis in MyD88null mice links elevated serum cholesterol levels to activation of innate immunity signaling pathways［J］.Nat Med，2004，10（4）：416－421.

［14］Magnusson MK，Mosher DF.Fibronectin：structure，assembly，and cardiovascular implications［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1998，18（9）：1363－1370.

［15］Tan MH，Sun Z，Opitz SL，et al.Deletion of the alternatively spliced fibronectin EⅢA domain in mice reduces atherosclerosis［J］.Blood，2004，104（1）：11－18.

［16］Babaev VR，Porro F，Linton MF，et al.Absence of regulated splicing of fibronectin EDA exon reduces atherosclerosis in mice［J］.Atherosclerosis，2008，197（2）：534－540.

［17］Schoneveld AH，Hoefer I，Sluijter JP，et al.Atherosclerotic lesion development and Toll like receptor 2and 4 responsiveness［J］.Atherosclerosis，2008，197（1）：95－104.

［18］Xu XH，Shah PK，Faure E，et al.Toll－like receptor－4is expressed by macrophages in murine and human lipid－rich atherosclerotic plaques and upregulated by oxidized LDL［J］.Circulation，2001，104（25）：3103－3108.

［19］Shamshiev AT，Ampenberger F，Ernst B，et al.Dyslipidemia inhibits Toll－like receptor－induced activation of CD8alpha－negative dendritic cells and protective Th1type immunity［J］.J Exp Med，2007，204（2）：441－452.

［20］Kanwar RK，Kanwar JR，Wang D，et al.Temporal expression of heat shock proteins 60and 70at lesion－prone sites during atherogenesis in ApoE－deficient mice［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2001，21（12）：1991－1997.

［21］Michelsen KS，Wong MH，Shah PK，et al.Lack of Tolllike receptor 4or myeloid differentiation factor 88reduces atherosclerosis and alters plaque phenotype in mice deficient in apolipoprotein E［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（29）：10679－10684.

［22］Hollestelle SC，de Vries MR，van Keulen JK，et al.Tolllike receptor 4is involved in outward arterial remodeling［J］.Circulation，2004，109（3）：393－839.

［23］Haase R，Kirschning CJ，Sing A，et al.A dominant role of Toll－like receptor 4in the signaling of apoptosis in bacteria－faced macrophages［J］.J Immunol，2003，171（8）：4294－4303.

［24］Ishikawa Y，Satoh M，Itoh T，et al.Local expression of Toll－like receptor 4at the site of ruptured plaques in patients with acute myocardial infarction［J］.Clin Sci（Lond），2008，115（4）：133－140.

［25］Methe H，Kim JO，Kofler S，et al.Expansion of circulating Toll－like receptor 4－positive monocytes in patients with acute coronary syndrome［J］.Circulation，2005，111（20）：2654－2661.