HBV核苷类似物耐多药的检测分析

范晓宁

深圳南山区人民医药感染科，广东深圳 518052

目前在我国，慢性乙型肝炎已经成为了一种临床常见传染性病症。慢性乙型肝炎会引起肝衰竭、肝硬化以及原发性肝细胞癌等并发症，给患者及其家属带来了严重的经济损失和心理负担，同时也给社会带来一定的影响[1]。在现阶段对慢性乙型肝炎进行治疗的方法主要有抗病毒、抗纤维化、抗炎保肝、免疫调节以及对症治疗等几种方式，在这众多方法中抗病毒是对慢性乙型肝炎进行治疗的重中之重。目前国家食品药品监督管理局批准的可以用来对慢性乙型肝炎患者进行抗病毒治疗的药物主要有干扰素和核苷酸类似物这两大类，干扰素类主要包括有普通IFNα-2b与聚乙二醇化IFNα-2a/2b;核苷(酸)类似物主要包括拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦以及替比夫定等。HBV是DNA病毒的一种，其自然史需要历经逆转录的一个阶段，然而逆转录酶对3,-5，外切酶相对比较缺乏，因此会使HBV很容易发生突变，所以在患者的体内其实病毒是以准种的形式存在[2]。在本次研究中，处于对HBV核苷类似物耐多药的检测进行分析的目的，我们抽取在过去一段时间在我院就诊的患有慢性乙型肝炎发生多药耐药的患者病例的临床治疗资料进行分析。以下为本次研究的结果报道。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机抽取在2005～2011年这对时间内在我院就诊慢性乙型肝炎患者发生多药耐药的病例18例，在所抽取的患者中有男性患者11例以及有女性患者7例，所有患者的年龄均在26～67岁之间，患者的平均年龄在44岁左右，以上所统计的患者的所有自然资料均不具有明显的统计学差异，可以在分析中予以应用。

1.2 诊断标准

患者接受拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦以及替比夫定等单独用药或者是联合用药进行治疗，并且存在治疗失败的情况，主要有发生了病毒学的突破或者是在进行治疗的48周后HBV DNA依旧比检测下限的患者要高，对依从性差等原因予以排除，自愿对详细病史资料予以提供并且通过病毒耐药检测被诊断为是多药耐药[3]。

1.3 方法

对所抽取的18例患者中采用克隆测序法在每位患者体内随机筛选60个克隆，对菌液聚合酶链反应以及经酶切进行鉴定结果为阳性的单克隆予以测序，并对患者出院3个月后进行随访，对患者的基因型以及耐药基因变异的模式进行分析。

1.4 数据处理

在本次研究过程中所得到的所有相关数据，均采用SPSS 14.0统计学数据处理软件进行处理分析，当P＜0.05时，我们认为数据之间有明显的统计学差异。

2 结果

对这18例患者出院后3个月进行随访，11例男性患者中HBeAg均呈现为阳性结果，7例女性患者的HBeAg均呈现阴性。在这其中被诊断为乙肝后肝硬化和肝细胞癌的患者有5例，被诊断为乙肝后肝硬化的患者有5例，其他的8例患者均被诊断为慢性乙型肝炎。在这18例患者中的所有标本的巢式PCR扩增均呈现阳性结果，阴性对照没有发生扩增。

3 讨论

作为强且有效的抗HBV药物,核昔(酸)类似物目前正面临着HBV耐药性所产生的严重挑战。正如过去的研究结果所说的那样,现阶段的核昔(酸)类似物不会对细胞核内的cccDNA产生较好的效果,所以在停药之后病毒的载量会出现反弹的现象,因此一般情况下应对患者进行较长时间的药物治疗。但是,用药时间过长会对耐药突变株的选择产生影响。拉米夫定作为第一个获得FDA批准的一个对HBV进行治疗的药物，其刚开始的耐药率大约为20%左右,而后几年时间里其耐药率则呈现出不断上升的趋势，约上升到40%～70%左右,已经对长期使用拉米夫定产生了严重的威胁。到目前为止,任何已经上市或者是即将投入使用的核昔(酸)类似物均存在不同程度的耐药现象[4]。对于一些结构相似，且具有作用机制的相同的药物之间也会存在交叉耐药性,这使原本就严峻的耐药问题更加雪上加霜。但是值得安慰的是,阿德福韦作为第二个被FDA予以批准的抗HBV核昔(酸)类似物，其耐药性不是十分的显著,并且不会和拉米夫定产生严重的交叉性耐药性；恩替卡韦作为第三个获的批准的核苷类似物其耐药性也相对比较轻微,但是还需要对其予以长期的临床观察。最近一段时间有文献曾报道说阿德福韦或者是恩替卡韦是在拉米夫定产生耐药的基础上产生治疗效果的,阿德福韦或恩替卡韦发生耐药的比率要比没有采用拉米夫定进行治疗的患者多很多[5]。

HBV对核苷类似物的耐药机制主要为以下几点：HBV聚合酶所涉及的功能范围主要为:末端蛋白，参与引发逆转录的过程；间隔蛋白、逆转录酶以及RNaseH。而逆转录酶的主要功能域有A-G这7个结构域[6]。目前对HBV聚合酶氨基酸序列进行编号采用的是曾经有相关学者所提出的分别对4个功能域进行编号的方法。以下的全部氨基酸序号都对这一编号方法予以了合理的例用。HBV逆转录酶C域203-206位氨基酸会形成具有保守性的YMDD基序，与一些其它的对RNA产生依赖的聚合酶相同,都是居于酶催化活性中心的一个主要的组成部分。虽然很难对HBV聚合酶进行纯化从而获得晶体的衍射结构,然而由于HBV以及HIV等的逆转录酶表现出比较明显的序列同源性关系,目前已有很多研究小组根据HIV聚合酶对HBV聚合酶的三维结构模型予以了模拟构建。HBV聚合酶也具有“右手构象”的特点,同样是由“拇指”、“掌”以及“手指”这三个亚功能域所组成的。在“掌”部，“手指”以及新加人的dNTP上其催化活性位点会与模板发生作用。“拇指”的主要作用就是对模板的定位和链的延伸进行参与。dNTP结合位点又被称作是dNTP作结合口袋，存在于“掌”与“手指”之间[7]。

产生HBV耐药性发生突变的主要原因是：任何对RNA产生依赖的聚合酶均不具有显著的校正功能,也就是指3，-5，外切酶的活性。因此与依赖DNA的聚合酶相比其具有很高的错配率。在HBV进行复制的周期过程中,对依赖RNA的聚合酶予以了两次的使用:第一次是存在于宿主细胞的RNA聚合酶Ⅱ自cccDNA进行转录而得到前基因组RNA；第二次是HBV的逆转录酶通过前基因组RNA逆转录对基因组DNA进行合成。因此,尽管HBV属于DNA的病毒,但是其发生突变的概率与其它的DNA病毒性比要高很多。HBV的突变率为在每个复制循环过程中，每个碱基会有10-4的机会，针对于每毫升的血清病毒载量为1012的病毒粒子的患者而言,HBV的复制率会达到每天1012病毒粒子。对这些理论数据进行分析得知，一个患者的体内所含的HBV每天几乎会发生1000次点的突变。HBV的基因组相对较小，仅为3.2Kb左右，其所具有的ORF均会与其他的ORF发生重叠。因此，往往1个点的突变会导致多个基因产物也随之发生变化[8]。所以，具有高突变率的HBV所引起的大部分的突变体对病毒来说都是有害的，但是只是一部分而已，还是会有一部分的突变是有利的，或者说在某种选择压力下是有意义的。相当大的一部分耐药准种所具有的复制能力要比野生型的低很多，因此在不存在药物选择压力的条件下，耐药准种的含量相当的少。但在对核昔(酸)类似物予以应用以后，很快耐药的HBV准种就将其它准种超过了从而占据了统治的地位。在停药以后，该统治地位又会重新被野生型所取代。

综上所述，作为抗HBV药物核昔(酸)类似物具有一定的治疗效果，它们仍将在一定时期内成为对HBV感染进行治疗的一个首选药物。由于人们已经比较深入的了解了抗HBV核昔(酸)类药在临床的应用过程中所产生的耐药性的机制与规律，也许能够通过对不同患者的HBV基因型以及表型进行监测从而制定出比较独特的抗病毒的治疗方案，进而使核昔(酸)类药所具有的抗HBV治疗作用能够得到更好地发挥。

[1]林向飞,林秀英，韩清锡.拉米夫定对慢性乙型肝炎肝硬化患者的疗效观察[J].中华肝脏病杂志，2009,10(14)：304-306.

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[3]谭小燕，胡世云.拉米夫定抗慢性乙型肝炎后肝纤维化的疗效[J].中华肝脏病杂志，2009,11(12):753-754.

[4]Bartho lomew M M，JansenRW.Jeffers L J.Hepatitis infection after ortho topic liver transp lantaton[J].Lancet,2007，349(9044)：120.

[5]王克霞,王健,张荣波.HBV血清学标志物与PCR HBV DNA检测结果的比较[J].锦州医学院学报,2009,20(14):232-233.

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