昆虫分子生物学分类技术及在植保上的应用前景

任海英，李 彤

（1.河南省卫辉市农业技术推广中心，河南 卫辉453100；2.河南省农业科学院植物保护研究所，河南 郑州450002）

1 引言

昆虫经过约3亿8千万年的演化，已经发展成为地球上种类繁多、数量巨大、分布广泛的动物类群之一。目前，已经定名的昆虫约有100多万种，占已知动物数量的2／3，但据不完全统计全世界仍约有90%的昆虫是还未定名的［1］。

传统的昆虫分类研究是通过观察、对比昆虫的外部形态特征，寻找昆虫间的差异，从而达到分类鉴定的目的。昆虫中常用的分类特征有翅脉、口器、触角、生殖器、足及其跗节等。这些分类特征在高级分类单元中可以很好地反映物种的分类地位，但在小的分类单元，如属、族、种内则不容易确定物种的分类地位，再到种群、生态型则更难确定分类地位。为此，必须寻找更细的形态特征，如某些部位毛片的形态、分布等，但这些特征又容易受非遗传稳定性的影响，而导致错误的结果［2］。传统的昆虫分类一方面具有直观、简单、快捷等优点，另一方面它又受制约于研究人员的主观意识，需要研究人员具有丰富的分类经验，而一个好的分类人员往往需要多年的培养。

随着科学技术的进步与各个学科的交叉渗透，已有200多年历史的昆虫分类学也获得了极大的发展。20世纪80年代以来，结合遗传学、生物化学和分子生物学背景的分类学技术已经广泛地应用到昆虫的分类研究中［3，4］。本文针对分子生物学技术在昆虫分类上的应用与发展进行阐述，对其在植保部门中的应用前景进行了分析。

2 昆虫分子生物学分类技术和方法

2.1 分子杂交技术

分子杂交技术（Molecular hybridization）是分子生物学中应用最广的技术之一，包括Southern分子杂交技术、Northern分子杂交技术和原位杂交技术。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链分子，在一定的条件下可按碱基互补原则，通过退火形成双链，在高度严格的实验条件下，不同种的核酸仅在互配的序列上配对，具有高度的特异性。Collins（1987）和牛玲玲等（1992）使用DNA探针杂交方法在双翅目按蚊属的类群中进行了分类研究［5，6］。分子杂交的好与坏，关键在于探针的选择，下面简述DNA探针的筛选方法：

（1）使用限制性内切酶对基因组DNA进行酶切反应，根据酶切片段的多态性，选择并回收合适的DNA片段，使用同位素将其标记为特异性的探针［6，7］。

（2）通过酶切、克隆的方法构建相应物种的基因文库，将其近缘物种的总DNA标记为探针，在基因文库中进行杂交，从中筛选出该物种特有的基因片段，标记为探针。

（3）根据核糖体基因的多态性，从基因文库中直接筛选核糖体基因探针。虽然杂交技术用于昆虫鉴定具有高度的特异性、精确性和敏感性［8］，但也有学者提出DNA探针的“种的特异性”有一定的适用范围［9］。另外，DNA探针的制备与使用总体费用较高，操作技术比较繁琐，并且同位素对人体具有一定的危害，这也制约了分子杂交技术在昆虫分类中的进一步推广与发展。

2.2 基因片段的体外扩增技术

1985年Kary Mullis等创建特异DNA片段的体外扩增的技术，主要是利用聚合酶依赖于DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在一对引物之间诱发聚合酶反应，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行。因此，该技术被命名为聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）。PCR的意义和影响甚至比限制性内切酶等更为深远，是分子生物学领域的一次创举，在一定程度上替代了传统的DNA克隆方法［10］。Kary Mullis也因此获得了1993的诺贝尔化学奖。就PCR循环条件来说，一般30～35个循环足以得到目的产物，其中退火温度的选择至关重要，原则上退火温度过低，会造成非特异性产物量增加，过高则会无扩增产物。在PCR基础上，又迅速发展起来了一系列DNA多态检测技术，如RFLP、RAPD、SSCP等，并很快被用于多种生物的物种鉴定、系统进化等的研究中。朴美花等（2002）用PCR技术对采于1980年和1987年的松毛虫脊茧蜂干标本进行基因组DNA的提取和PCR扩增均获得成功［11］。Nielsen等（1999）利用形态学和以PCR技术为基础的线粒体分型技术来识别非洲化蜜蜂，成功区别了来自4个种族的母系后代［12］。

2.3 RFLP技术

RFLP技术（限制性片段长度多态性分析，Restriction fragment length polymorphism）是基于不同的个体在等位基因上存在着碱基组成的差异，通过限制性内切酶识别特异的酶切位点，将这些碱基差异反映在酶切片段的大小和组成上，从而达到区分的目的。目前，RFLP技术一般和PCR技术一起使用。在使用RFLP技术鉴定物种时，若需鉴别的物种具有较小的基因组或目的基因序列较短，其酶切片段的多态性直接可以通过跑聚丙烯酰胺胶或琼脂糖凝胶进行观察；但对于大分子DNA来说，其鉴定还需和DNA杂交技术相结合。乔传令等（1996）对库蚊的限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）进行实验研究，结果表明不同地理种群都有相同的单基因扩增，但扩增水平上有较大差异［13］。龙漫远（1993）针对线粒体DNA进行了相应的RFLP研究，得到了其相应的酶切图谱和片段多态性［14］。赵惠燕等（1997）利用同样的方法在同翅目昆虫中进行了分类研究［15］。应用RFLP分析方法，使传统的昆虫分类和区系进化研究有了新的发展和飞跃，并且解决了一些利用传统分类方法不能解决的问题。

2.4 RAPD技术

RAPD技术（随机扩增DNA多态性分析，Random amplified ploymorphic DNA）是1990年由 Willioms和Welsh两个研究小组同时发展起来的一项分子多态性检测技术。RAPD标记的产生是基于一种可能性，即一段与某一单一引物RAPD（一般用10聚体引物）同源的DNA序列［16］，有可能在DNA模板另一条链上的不同位置上出现，这些位置之间的距离又处于通过PCR进行扩增的长度范围。因此，当条件满足时，单个寡核苷酸引物就可以在PCR反应中介导DNA呈几何级数扩增。经RAPD检测，大多表现为某一个扩增产物出现或消失，这意味着RAPD通常可用作显性标记［17］。通过对RAPD的结果分析和相应序列的测序，可以筛选出针对于某一种群、生物型或物种的特有片段，并根据其序列设计特异引物，达到特异性检测的目的，从而延伸出了一种更加特异的检测技术——特征序列扩增区域（sequence characterized amplified region，SCAR）。RAPD技术已经被应用在蚊虫的分子系统学研究中［18～20］。苏松坤等（2002）利用 RAPD分子遗传标记，筛选出了5种引物，这些引物所扩增的RAPD标记可作为鉴别欧洲蜜蜂和非洲蜜蜂的分子标记［21］。

2.5 SSCP和DSCP技术

SSCP方法（单链构象多态性分析，Single－strand conformational polymorphism）和DSCP方法（双链构象多态性分析，Double－strand conformational polymorphism）的基本原理相似，采用PCR技术扩增出某一特定的DNA片段，在高温下使双链DNA变性为单链DNA（ssDNA），然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，ssDNA带在凝胶中位置的差异反映了DNA序列的差异。

2.6 DNA条形码技术

DNA条形码（DNA Barcoding）是由加拿大生物学家Paul Hebert等提出的生物快速鉴定的概念［22］，是通过在不同的生物类群中选择合适的基因片段，针对基因片段的序列进行分析，将物种的差异反映在基因序列上，从而达到区分物种的目的，类似于超市中分类货物所使用的条形码。目前全世界生物共有1580920条已公布的Barcoding序列信息，其中昆虫有1036188条，详见DNA 条形码网站（http：／／www.boldsystems.org／views／login.php）。昆虫DNA条形码鉴定中选择的基因是线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COI），其具有稳定、易扩增、变异速率适中等优点。DNA条形码鉴定物种的操作步骤如下。

（1）使用通用引物在待测样品DNA中进行基因扩增；

（2）测序得到相关序列；

（3）将序列提交网站和数据库已有序列进行比对；

（4）网站根据比对结果，给出样品最相似的物种信息。

我国作为DNA条形码国际组织中的一个重要节点，大量的相关研究工作正在开展。

3 昆虫分子生物学鉴定技术在植物保护中的应用

植物保护是针对于田间作物病虫害预警与防治的一门科学，是我国粮食生产安全的重要保障。据不完全统计现在全国共有县级以上植保技术推广和管理机构2905个，其中地、市、县级2342个，乡（镇）级综合性农技服务的农技站30000余个，其中基层植保部门在病虫害的预警与相关防治方法的推广上扮演着重要的角色。害虫防治一直是植保工作中的重要一环，但要做到防治，首先要学会识别。因此，昆虫分类对于更好地开展植保工作也是必须的。目前，由于多种原因，在基层植保部门中，往往缺少具有昆虫分类知识的高级技术人才。

传统的分类学技术具有直观、简单、快捷、经济等优点，并且历史悠久，形成了一套相对成熟的分类系统，但是这种方法依赖经验的积累，需要较长时间的系统学习才能掌握，而且其扩展性不强，也就是说某个昆虫类群的分类专家并不能完成其他类群的分类鉴定。而现代生物学技术则具有准确、客观、灵敏等优点，能够鉴定出形态学不能区分的昆虫亲缘种，正好弥补形态学方法的不足，而且其操作性更强，不需要掌握大量的分类知识，仅仅需要相关的分子生物学知识，就能在多个类群中开展。另外，现在分子生物的仪器、试剂和测序费用大幅降低，也使得在基层植保部门当中适当开展相应的分子生物学昆虫鉴定成为可能。

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