聚酰胺胺树形化合物基因载体的研究进展

王 翔，郭良君，孔飞飞，高 申

（1.解放军第98医院药械科，浙江湖州313000；2.第二军医大学长海医院药学部，上海200433）

聚酰胺胺（polyamidoamine，PAMAM）树形化合物是一种高度分枝辐射状对称的球形新型高分子聚合物，由美国化学家Tomalia等人于1985年首次合成。1993年，Haensler和Szoka首次尝试将PAMAM作为非病毒载体用于体外基因转染，它的高度分枝化、球体结构、外表面多价电荷分布、分子内部大量空腔、单分散性、高度可溶性使其具备独特的性质和特点。相对于其他阳离子聚合物，PAMAM的体积大小、分子质量、分枝数目、表面末端基团密度及种类都是专一可控的。根据不同的用途，可获得结构精细、规整，大小和表面功能确切的树形分子，它内部具有大量空腔，可以携带更多的药物。另外，PAMAM是非生物材料，无免疫原性和遗传毒性，在正常生理条件下，分子表面的末端基团氨基呈弱碱性而带有正电荷，因此它可以与天然状态下一切带有负电的生物分子结合，在药物递送、基因转染、疾病诊断、影像显影等领域有很广泛的应用。

1 PAMAM－DNA复合物的传导过程

PAMAM与DNA的结合与其他阳离子化合物一样，主要是通过电荷作用。表面带正电荷的树形化合物（dendrimer）与核苷酸分子中带负电的磷酸根静电作用结合，DNA会因化合物的合成代数和电荷比的不同而被不同程度地压缩，进而自我组装成树形化合物－核酸分子复合物。这一过程只改变DNA的二级结构，并不引起其一级结构的改变，也是介导遗传物质转移的起始步骤与关键性参数。DNA纳米粒子被哺乳动物细胞摄取的大致过程如下［1］：DNA被阳离子化合物缩合形成规则的纳米结构，如球形、环形和柱形结构等，到达靶细胞后，纳米粒子与靶细胞表面的阴离子蛋白聚糖等相互作用，通过内吞入胞等方式被转运至细胞内。阳离子物质在酸性的吞噬囊泡内聚集，增加内吞泡的pH值，从而抑制DNA被溶酶体酶降解，它们还可引起质子的内流，使内吞泡失去稳定，使DNA被释放到细胞质中，DNA于是通过核孔或在核定位信号介导下进入细胞核，并离开阳离子载体解缩合而复原成生物活性的DNA，进而发挥效应。有报道认为，当两者正负电荷比（N／P）＜1时，由于压缩的程度较低，对DNA的保护作用是不完全的，电镜下观察到，大多数质粒DNA被压缩成孤立的环状分子，但是仍可见大而不规则的复合物沉淀［2］。另外，树形化合物与DNA复合物的形成还受到DNA浓度、树形化合物分子及核苷酸分子大小的影响。当PAMAM－DNA复合物N／P＞1时，复合物表面呈净正电性，可以与细胞膜表面带有负电的糖蛋白和磷脂静电结合，经液相内吞作用入胞形成内涵体。由于聚合物表面氨基的弱碱性可使内涵体内pH升高，利于复合物从内涵体中脱离而释放到细胞质内。被溶酶体融合的复合物，必须在被溶酶体酶降解之前“逃离”才能发挥作用。在溶酶体强酸性环境中，复合物内部的叔胺基团高度质子化而使得大量氯离子内流，造成溶酶体渗透性肿胀，最终破裂而将复合物释放，这就是溶酶体的“质子海绵效应（proton sponge effect）”［3］。释放到细胞质中的复合物约30min后进入细胞核，具体机制尚不清楚，目前有两种可能：（1）带正电的PAMAM－DNA复合物与带负电的磷脂膜结合而被包被；（2）内涵体破裂时复合物仍与内涵体磷脂膜紧贴在一起，随后磷脂膜与核膜融合，把复合物释放入细胞核内。与脂质体相比，PAMAM载DNA或者质粒DNA更稳定，效率更高。这一方面源于PAMAM的结构，更主要源于表面氨基较低的pKa值（3.9～6.9），使其在溶酶体中可以缓冲较大的pH值变化而不被降解。

2 PAMAM的毒性以及转染效率

高效、低毒的基因载体是基因治疗进入临床使用的必要条件，因此高效率和低毒性也就成为开发新的基因载体的目标。基因载体的效率可用细胞转染率及编码外源蛋白质的表达量来表示，它与载体能否有效地保护外源基因免于水解酶的破坏，并促进其突破各种生物膜屏障进入细胞核等适于基因表达的细胞器内有关。基因载体的毒性根据聚合物的侵害对象可分为细胞毒性、血液毒性和组织毒性，其中细胞毒性是体外基因转染时评价基因载体的一个重要指标。

PAMAM的毒性受表面特征的影响，表面带正电基团的PAMAM分子很容易破坏细胞膜，引起膜破裂，由此造成的细胞毒性呈浓度和合成代数依赖性［4］。目前国际上对于纳米粒子性质的描述和其安全性的评估实验系统没有形成统一规范化的标准。Kukowska－Latallo等［5］用20种不同的PAMAM装载两种不同的报告基因，在不同的pH值、不同的N／P值和外加试剂的条件下，分别转染了18种真核细胞，发现合成第3代～第10代（G3～G10）PAMAM可以在生理条件下与DNA形成稳定的复合物。G5～G10PAMAM由于表面氨基基团和自身球形结构可以同时与磷脂膜和DNA结合而实现基因转染，对细胞的毒性呈聚合物浓度和合成代数依赖性，并且与细胞类型有关。Hill等［6］检测了一系列PAMAM树状物的细胞毒性，并与聚赖氨酸作比较。结果表明，大多数PAMAM分子对HepG2及HL－60细胞株无毒副作用，但其中NG30（核心分子为亚甲二丙烯酰胺及二甲基乙烯二胺）与聚赖氨酸有相似的毒性；而以二丙烯哌嗪及2－甲基哌嗪为共核心分子的NG37、NG38、NG39对上述两种细胞株有轻度毒性。Malik等［7］检测了一组树状物的体外毒性，包括PAMAM（Starburst）、聚氧乙烯和硅烷的接枝共聚物（CSi－PEO）和聚丙稀亚胺树状物（DAB－dendrimer或DAE－dendrimer）。结果发现，以氨基为端基的树状物的溶血毒性依赖于合成代数和树状物的浓度，CSi－PEO和以－COONa为端基的树状物既没有溶血毒性也没有细胞毒性。研究还发现，高代的PAMAM由于固有的毒性，不适合注射给药。对同一类树状物而言，树状物载体的毒性随着分子质量的增大而增大。以上研究表明，树状物载体的细胞毒性与自身结构关系密切。Thomas等［8］用乙酰化方法获得表面氨基覆盖率不同的G5 PAMAM聚合物，经荧光标记后转染KB细胞（HeLa细胞的一个亚系），发现将40%的氨基乙酰化时，开始逐渐显示出毒性，表明氨基介导细胞毒性的高度相关性。Parimi等［9］研究PAMAM浓度、合成代数与其内吞作用和毒性的关系，分别转染了HEK293T细胞和HeLa细胞后发现，聚合物对细胞促进和抑制的作用转折点浓度为500nmol／L，当浓度为700nmol／L时，细胞呈现负增长，确定了500～700nmol／L这个高效、低毒的转染浓度窗。此外，他们巧妙地设计了脂质体泄漏实验，模拟细胞被聚合物侵袭形成微孔最终崩解的过程，定性分析了聚合物对细胞的覆盖率与毒性的大小呈浓度与合成代数的依赖性。总体来说，阳离子聚合物的毒性大于阴离子聚合物，线性聚合物的毒性大于树形聚合物，表面端基的种类也很重要，氨基的毒性大于羧基或羟基，伯胺的毒性大于叔胺和仲胺［3］。

阳离子聚合物载体和阳离子脂质体的转染机制相似，两者转基因的效率主要与载体的组成、载体与DNA的N／P、转染组织或细胞类型、DNA进入细胞质或细胞核的效率，以及阳离子聚合物的稳定性有关。尽管不同的研究者对N／P这一比例的确定数值看法不尽相同，但普遍认为应＞1。载体的比例越高，转染效率就越高，而细胞毒性也随之增大。因此，阳离子载体与基因的用量比例合适才能获得最佳的转染条件。DNA复合物带有过量正电荷对转染很关键，可增强与带负电荷的细胞膜的结合力，使进入细胞的复合物的量增加。而且由于血清蛋白带负电荷，可与阳离子脂质结合使DNA从复合物中分离出来而使之降解，也可造成复合体凝聚，通过网状内皮系统排出，而过量的正电荷可以减小或消除这些影响。在体内的转染研究发现，PAMAM在肾脏中表达水平最高，在肝、肺、脾中也有高表达，在心、脑、胃、肠中表达水平较低［10］。但是到目前为止，PAMAM在体内的代谢过程和具体分布尚不清楚。另外，阳离子载体－DNA复合物的稳定性也会影响基因的转染效率。稳定性越好，基因进入细胞质和细胞核的效率越高，则转染效率也越高。

3 PAMAM作为基因载体的优化

虽然相比于裸基因或其他非病毒型基因载体，如脂质体、聚乳酸等，PAMAM介导的细胞转染效率都较高，但是为了得到高效、低毒，适合基因递送的载体，常常以不同方式优化PAMAM，通过改变自身的性质以适应基因递送的需求。

3.1 N／P值和合成代数的大小 不同实验室运用的PAMAM种类、细胞类型以及实验条件的差异，摸索出的体外最优转染条件也不完全一致。Santos等［11］用G5、G6、G7三代PAMAM在不同N／P下转染间质干细胞，总结出G5和G6PAMAM在N／P为10时的转染效率最高。Zhou等［12］用G7PAMAM装载siRNA，在N／P为1∶10～20∶1时转染A549Luc细胞。结果表明，G7PAMAM N／P在该范围可获得明显的基因沉默效应。Braun等［13］用G2、G4、G7、G9PAMAM－DNA在不同N／P（1～5、10）时转染仓鼠卵巢细胞CHO－K1。结果在N／P为5时，所有PAMAM－DNA的粒径均达最小且转染效率明显提高，以G4PAMAM提高幅度最大。

3.2 热降解 用加热的方法降解PAMAM分子，使其严格规整的结构分散开来，增加了其转染灵活性，有利于其与DNA更紧密结合，在释放DNA时更易于膨胀，转染效率明显提高。热降解是一个随机的激活过程，通过对PAMAM水溶液加热不同的时间，形成了在分子质量和结构上有细微差别的混合组分。随着加热时间的延长、N／P的增大，PAMAM－DNA分子粒径逐渐减小，而对完整PAMAM则无明显变化。Navarro等［14］对G4和 G5PAMAM在HepG2细胞中进行的转染实验表明，通过加热的方式活化聚合物，在N／P为6，活化时间为24h时，G5PMAMA的转染效率最高，显著高于未活化的聚合物。目前，已商品化的树状大分子基因载体Superfect就是经降解的PAMAM分子。

3.3 纳米载体的修饰 对树形分子末端进行表面修饰可以改变其化学属性，影响其物理性质，如电荷、亲水性、溶解度等，也是目前研究最为广泛的对阳离子聚合物载体的优化方式。Qi等［15］报道以G5、G6PAMAM为对照，用4%、8%、15%（PEG结合PAMAM表面氨基的摩尔比）PEG－PAMAM G5、PEG－PAMAM G6载报告基因，经肌内注射后转染肌细胞，与同代的PAMAM 相比，8%的PEG－PAMAM介导的报告基因表达水平最高，随着摩尔比的增加，细胞相对存活率也增加，且与浓度呈负相关。PEG－PAMAM表面连接上狂犬病毒糖蛋白（RVG29）作为配体，形成PAMAM－PEG－RVG29／DNA复合物并在新生小鼠上进行实验。结果发现其在大脑中有明显的高表达，这可能与大脑屏障中丰富的GABAB受体有关［16］。除此之外，还有学者在PAMAM表面连接乳铁蛋白、叶酸等做配体，同样达到靶向转染的目的。Nam等［17］将精氨酸分别连接到G2、G3、G4PAMAM上，与DNA形成新的复合物e－PAMAM，并与未修饰的PAMAM做了比较，发现在HUVEC细胞中，e－PAMAM G4的毒性和转染效果都较未修饰前提高。在以羟基为末端的PAMAM表面连接精氨酸，可以有效缓冲溶酶体内的酸碱度变化，有利于DNA由溶酶体释放入细胞质，进而进入细胞核参与核内反应［18，19］。此外，Deng等［20］用环糊精修饰过的PAMAM在成纤维细胞中转染siRNA，发现转染效率明显提高，而且毒性显著降低，同时修饰上去的环糊精还可以起到携带疏水性药物如抗癌药的作用。Wu等［21］用PEG化的PAMAM连接具有前列腺癌靶向的RNA适体A10，与miRNA－15a和miRNA－16－1形成复合物。细胞转染实验表明，复合物具有较好的前列腺靶向作用。Yu等［22］用五乙烯六胺（pentaethylenehexamine，PEHA）修饰PAMAM，然后连接PEG，形成PEG－PAMAM－PEHA聚合物，最后在PEG的一端连接表皮生长因子（EGF），通过肝癌细胞HuH－7转染实验证实，复合物转染pDNA效率为未连接EGF的复合物的10倍，为肿瘤的治疗提供了新的思路。

3.4 其他 在PAMAM－DNA体系中加入一些试剂可以提高转染效率。氯喹呈弱碱性，在复合物或培养介质中加入氯喹，经细胞摄取后能升高核内体的pH值，从而抑制核内体－溶酶体之间的融合，有助于复合物从核内体中脱离出来，避免了DNA被核酸酶降解，从而有效提高了转染的效率［23］。此外，由于核内体中的pH值约为5.5，PAMAM在pH 5～7具有极强的缓冲能力，因而也具有较高的转染效率［24］。这是由于高缓冲能力的阳离子载体随着核内体的酸化而使内部叔氨基质子化，可作为弱碱基对而显示出抗核内体酸化的作用，复合物正电荷密度增高，部分原来为了维持电荷平衡而与DNA结合的载体从复合物中解离出来，导致核内体肿胀和渗透压的升高，核内体膜更容易破裂，有助于复合物的逃逸。高合成代的PAMAM分子由于表面电荷密度过大易于聚集，影响转染效率，而分散剂二乙氨乙基葡萄糖的加入则可以中和部分电荷，使聚集体得到分散，从而提高转染效率［7］。

4 展 望

自1990年世界上第一例利用基因疗法治疗人类疾病的临床试验开始，至今基因治疗已有20多年。在这20多年中，基因治疗的技术和方法都有了极大的改进，应用的范围也从一开始的遗传性疾病到现在的肿瘤、感染性疾病以及退行性疾病等。为了使目的基因或携带目的基因的载体能高效特异地转导入靶细胞，减少基因载体复合物在体内与非靶向物质的结合，提高目的基因在靶细胞中的聚集浓度，人们在载体表面连接一些靶向分子，实现了基因的靶向转染。

近年来，RNA干扰和反义RNA的转录抑制技术作为两种有力的基因灭活技术，在许多疾病的临床治疗方面有所发展，特别是在肿瘤治疗中，常用于抑制或封闭某些癌基因的表达。有学者用PAMAM载热休克蛋白27（Hsp27）siRNA介导对前列腺癌细胞系的转染，有效封闭了Hsp27基因的表达，抑制了癌细胞生长并有效诱导其凋亡，为前列腺癌的基因治疗寻求到一种新的方法［25］。与此同时，Ren等［26］利用反义技术将反义miRNA－21（人脑胶质瘤抗凋亡因子）和氟尿嘧啶用PAMAM递送到胶质母细胞瘤细胞中，这种共转染不仅有效抑制了人脑胶质瘤抗凋亡因子的表达，而且提高了化疗药物的药效，增加肿瘤细胞的凋亡并抑制其迁移能力。介于此种技术效率高、针对性强的特点，目前基因灭活疗法已逐渐成为癌症治疗中最有潜力也是最活跃的研究方向。另外，基于树形化合物独特的三维结构、多分散性、表面活性基团和模拟功能，药物分子可被封装载入到聚合物内部，也可通过静电作用或共价键被吸附到表面，这大大提高了药物装载量和投递率。因此，PAMAM目前已用于多种肿瘤化疗药物的递送系统研究中。此外，PAMAM介导药物运输还可以增加药物的溶解性和渗透性，并延长药物在细胞内的滞留时间［27］。针对PAMAM大分子的特点，可用它携带某些小分子药物。研究者发现这类复合体很难进入胎盘屏障，特别是当药物半衰期相对较短时，效果更加明显，这一研究也为孕妇的疾病治疗开辟了新的思路［28］。

作为非病毒基因载体，PAMAM还存在一些尚待解决的问题，如由于高分子的降解速率慢而带来的相对高毒性、DNA转染至细胞核内的障碍等。然而，随着人们对PAMAM基因载体的设计和完善，PAMAM基因载体必将在基因治疗中发挥举足轻重的作用。

［1］ Vijayanathan V，Thomas T，Thomas T J.DNA nanoparticles and development of DNA delivery vehicles for gene therapy［J］.Biochemistry，2002，41（48）：14085－14094.

［2］ Bielinska A U，Kukowska－Latallo J F，Baker J R Jr.The interaction of plasmid DNA with polyamidoamine dendrimers：mechanism of complex formation and analysis of alterations induced in nuclease sensitivity and transcriptional activity of the complexed DNA［J］.Biochim Biophys Acta，1997，1353（2）：180－190.

［3］ Lin Chao，Engbersen J F J.Effect of chemical functionalities in poly（amido amine）s for non－viral gene transfection［J］.J Control Release，2008，132（3）：267－272.

［4］ Svenson S，Tomalia D A.Dendrimers in biomedical applications－reflections on the field［J］.Adv Drug Deliv Rev，2005，57（15）：2106－2129.

［5］ Kukowska－Latallo J F，Bielinska A U，Johnson J，et al.Efficient transfer of genetic material into mammalian cells using Starburst polyamidoamine dendrimers［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93（10）：4897－4902.

［6］ Hill I R C，Garnett M C，Bignotti F，et al.In vitro cytotoxicity of poly（amidoamine）s：relevance to DNA delivery［J］.Biochim Biophys Acta，1999，1427（2）：161－174.

［7］ Malik N，Wiwattanapatapee R，Klopsch R，et al.Dendrimers：relationship between structure and biocompatibility in vitro，and preliminary studies on the biodistribution of125I－labelled polyamidoamine dendrimers in vivo［J］.J Control Release，2000，65（1－2）：133－148.

［8］ Thomas T P，Majoros I，Kotlyar A，et al.Cationic poly（amidoamine）dendrimer induces lysosomal apoptotic pathway at therapeutically relevant concentrations［J］.Biomacromolecules，2009，10（12）：3207－3214.

［9］ Parimi S，Barnes T J，Callen D F，et al.Mechanistic insight into cell growth，internalization，and cytotoxicity of PAMAM dendrimers［J］.Biomacromolecules，2010，11（2）：382－389.

［10］ Zhong Hui，He ZhiGuo，Li Zheng，et al.Studies on polyamidoamine dendrimers as efficient gene delivery vector［J］.J Biomater Appl，2008，22（6）：527－544.

［11］ Santos J L，Oramas E，Pêgo A P，et al.Osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells using PAMAM dendrimers as gene delivery vectors［J］.J Control Release，2009，134（1）：141－148.

［12］ Zhou JieHua，Wu JiangYu，Hafdi N，et al.PAMAM dendrimers for efficient siRNA delivery and potent gene silencing［J］.Chem Commun（Camb），2006，14（22）：2362－2364.

［13］ Braun C S，Vetro J A，Tomalia D A，et al.Structure／function relationships of polyamidoamine／DNA dendrimers as gene delivery vehicles［J］.J Pharm Sci，2005，94（2）：423－436.

［14］ Navarro G，de ILarduya C T.Activated and non－activated PAMAM dendrimers for gene delivery in vitro and in vivo［J］.Nanomedicine，2009，5（3）：287－297.

［15］ Qi Rong，Gao Yu，Tang Yin，et al.PEG－conjugated PAMAM dendrimers mediate efficient intramuscular gene expression［J］.AAPS J，2009，11（3）：395－405.

［16］ Liu Yang，Huang RongQin，Han Liang，et al.Brain－targeting gene delivery and cellular internalization mechanisms for modified rabies virus glycoprotein RVG29nanoparticles［J］.Biomaterials，2009，30（25）：4195－4202.

［17］ Nam H Y，Hahn H J，Nam K，et al.Evaluation of generations 2，3and 4arginine modified PAMAM dendrimers for gene delivery［J］.Int J Pharm，2008，363（1－2）：199－205.

［18］ Kim T I，Bai ChengZhe，Nam K，et al.Comparison between arginine conjugated PAMAM dendrimers with structural diversity for gene delivery systems［J］.J Control Release，2009，136（2）：132－139.

［19］ Nam H Y，Nam K，Hahn H J，et al.Biodegradable PAMAM ester for enhanced transfection efficiency with low cytotoxicity［J］.Biomaterials，2009，30（4）：665－673.

［20］ Deng JunJie，Li Na，Mai KaiJin，et al.Star－shaped polymers consisting of aβ－cyclodextrin core and poly（amidoamine）den－dron arms：binding and release studies with methotrexate and siRNA［J］.J Mater Chem，2011，21：5273－5281.

［21］ Wu Xin，Ding BaoYue，Gao Jing，et al.Second－generation aptamer－conjugated PSMA－targeted delivery system for prostate cancer therapy［J］.Int J Nanomedicine，2011，6：1747－1756.

［22］ Yu HaiJun，Nie Yu，Dohmen C，et al.Epidermal growth factor－PEG functionalized PAMAM－pentaethylenehexamine dendron for targeted gene delivery produced by click chemistry［J］.Biomacromolecules，2011，12（6）：2039－2047.

［23］ Felgner J H，Kumar R，Sridhar C N，et al.Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations［J］.J Biol Chem，1994，269（4）：2550－2561.

［24］ Akinc A，Langer R.Measuring the pH environment of DNA delivered using nonviral vectors：implications for lysosomal trafficking［J］.Biotechnol Bioeng，2002，78（5）：503－508.

［25］ Liu XiaoXuan，Rocchi P，Qu FanQi，et al.PAMAM dendrimers mediate siRNA delivery to target Hsp27and produce potent antiproliferative effects on prostate cancer cells［J］.Chem Med Chem，2009，4（8）：1302－1310.

［26］ Ren Yu，Kang ChunSheng，Yuan Xubo，et al.Co－delivery of as－miR－21and 5－FU by poly（amidoamine）dendrimer attenuates human glioma cell growth in vitro［J］.J Biomater Sci，2010，21（3）：303－314.

［27］ Jiang YanYan，Tang GuoTao，Zhang LiHong，et al.PEGylated PAMAM dendrimers as a potential drug delivery carrier：in vitro and in vivo comparative evaluation of covalently conjugated drug and noncovalent drug inclusion complex［J］.J Drug Target，2010，18（5）：389－403.

［28］ Menjoge A R，Rinderknecht A L，Navath R S，et al.Transfer of PAMAM dendrimers across human placenta：prospects of its use as drug carrier during pregnancy［J］.J Control Release，2011，150（3）：326－338.