玻璃化与程序化对人早期胚胎冷冻复苏效果观察

张若鹏，吴 睿，张丽蓉，朱 莉

（大理学院附属医院 生殖医学科，云南 大理 671000）

胚胎冷冻是体外受精-胚胎移植重要衍生技术。玻璃化冷冻方法保存胚胎于1998年Mukaida等首次报道玻璃化冷冻保存人类卵裂期胚胎获得成功[1]。2004年王俊霞等报道了我国第1例早期胚胎应用玻璃化冷冻方法后获得分娩[2]。该方法能够克服程序冷冻方法设备昂贵、耗时长、费用高、难以避免冷冻过程中冰晶形成对胚胎的损伤等缺点，有望获得更高的胚胎存活率。目前已成为体外受精-胚胎移植中研究的热点并在临床上得到迅速的推广与应用。我科于2010年4月至今，将玻璃化冷冻技术临床应用于临床，取得满意的效果，本文对进行程序化和玻璃化冻融胚胎移植69周期进行回顾性分析，比较2种冷冻方法对人早期胚胎的冷冻复苏效果。

对象与方法

一、一般资料：2010年4月至今在本科接受冻融胚胎移植69周期，玻璃化冷冻复苏32个周期，程序化冷冻复苏37个周期。不孕原因主要是男方因素与女方输卵管因素及排卵障碍，排除子宫内膜异位症、子宫肌瘤和其他可能影响胚胎着床的因素。患者的平均年龄、不孕年限和子宫内膜厚度组间均无显著性差异（P>0.05），具有可比性。

二、冷冻胚胎的选择标准：参照中华医学会编著[3]的卵裂期第2天胚胎四级评分法。1级：胚胎发育速度正常，卵裂球均匀、数目均等，细胞质均一、无空泡，碎片不超过5%；2级：胚胎发育速度正常，卵裂球均匀或大致均匀、数目均等或大致均等,细胞质均一、无空泡，碎片5%～10%；3级：胚胎发育大致正常，卵裂球不均匀/均匀、数目不均等/均等，细胞质中有少量空泡，少于15%碎片；4级：胚胎发育速度异常，卵裂球不均匀、数目不均等，细胞质不均一、有大量空泡，10%～50%碎片。

三、玻璃化法：①胚胎冷冻 解冻试剂盒采用日KITAZATO公司的玻璃化冷冻、解冻试剂套盒,冷冻载杆为cryotop。在室温下将胚胎（最多3枚）移入平衡液（equilibration solution）中，胚胎首先皱缩,然后逐渐扩张，最后基本恢复至原状，预平衡约5～7min，之后移入玻璃化冷冻液(vitrification solution)中，充分混合后迅速将胚胎置于cryotop的顶端，并迅速投入液氮中,时间控制在60s之内。②胚胎解冻 将cryotop从液氮中取出后,迅速将其顶端置入37℃预温的解冻液（thaw solution）中约1min，然后在室温下将胚胎依次转人稀释液（dilute solution）、洗涤液1（wash solution 1）、洗涤液2（wash solution 2）中，分别停留3、5、5min,最后将胚胎移入胚胎培养液中，置37℃，5%CO2培养箱中培养1～2h后以备移植。

四、程序化法：①胚胎冷冻 将胚胎经过溶液F1[体积分数20%人血清白蛋白SSS]平衡10min,再移入F2[（1.5mol/L丙二醇（PROH）+体积分数20%SSS)]平衡10min,随后移入F3（1.5 mol/LPROH+0.1mol/L蔗糖+体积分数20%SSS）平衡10 min,将标本装入程序降温仪（澳大利亚CL3500）进行冻，起始温度20℃，以-2℃/min逐步降温于-7℃稳定5min后进行植冰，停留10min后以-0.3℃/min缓慢降温至-30℃，之后以-30℃/min迅速降温至-197℃，标本取出迅速投入液氮中保存。②胚胎解冻 采用快速解冻法解冻胚胎，将胚胎从液氮中取出后，30℃水浴30 s，室温下放置30 s后投入0.2mol/L蔗糖＋1.0mol/LPROH 5min，再投入0.2mol/L蔗糖＋0.5mol/LPROH 5min，再入0.2mol/L蔗糖5min，转入胚胎培养液中培养，待移植。

五、胚胎解冻后的观察：胚胎解冻后判定胚胎存活的标准是 胚胎卵裂球数50%以上完整并存活，颜色明亮均一，立体感较强；卵裂球存活的标准是 具有完整清晰的细胞膜、胞质均匀光泽、立体感强。

六、冻融胚胎移植及临床妊娠的确认：解冻当日选择存活的胚胎进行宫腔内移植，移植14d后测定血或尿人绒毛膜促性腺激素水平，移植35d后行B超监测，见有孕囊者，确认为临床妊娠。

七、统计学方法：使用SPSS13.0软件包进行统计分析，组间比较主要采用t检验和χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

玻璃化冷冻复苏32个周期的102枚早期胚胎，存活92枚，胚胎存活率为90.20%（92/102）。胚胎种植率为19.57%（18/92），妊娠率31.25%（10/32），2011年4月24日滇西首例玻璃管化试管女婴儿健康问世。程序化冷冻复苏37个周期，解冻122个胚胎,存活67个，复苏存活率为55.0%（67/122），胚胎种植率为10.44%（7/67），妊娠率10.81%（4/37）。玻璃化组的复苏存活率、胚胎种植率、临床妊娠率均高于程序化组（P＜0.05）。

讨 论

本研究显示相对程序化冷冻，玻璃化冷冻保存人类早期胚胎，胚胎复苏存活率、种植率、临床妊娠率均高于程序化组（P＜0.05），是冷冻保存人类胚胎的理想方法，提示玻璃化法冻融胚胎有较好的复苏效果和发育潜能。在冷冻过程中，胚胎会发生多种冷冻损伤，其中冰晶的形成是造成冷冻损伤的最主要因素[4]。程序化冷冻技术难以杜绝冰晶造成的冷冻损伤。解冻后的胚胎有3种表现：全部卵裂球完整、部分卵裂球完整和所有卵裂球损伤死亡。通常以解冻后胚胎复苏的卵裂球细胞数≥总细胞数的50%作为可移植胚胎的标准。玻璃化冷冻一方面冷冻保护剂浓度高，卵裂球脱水充分，另一方面由于温度快速下降，不易形成冰晶，减少了胚胎或细胞的机械性损伤，减少了由于没有可移植胚胎而导致的周期取消率。此外玻璃化冷冻法还能克服程序化冷冻的一些缺点，比如昂贵的程序化冷冻仪的运行损耗大、冷冻耗时长、多管胚胎同时冷冻时等待时间延长等，而且如果冷冻仪在运行中出现故障，将会给胚胎带来无法挽回的损伤。因而玻璃化法是更适合中国国情的理想的冷冻技术，有望在冷冻人类卵子、胚胎中得到广泛的运用。综上所述，玻璃化法冷冻胚胎的复苏效果明显好于程序化法，玻璃化法能够较好地保存冷冻胚胎复苏后的发育潜能，适用于卵裂期胚胎的冷冻保存。

［1］ MUKAIDA T,WADA S,TAKAHASHIK,etal.Vitrification of human embryos based on the assessment of suitable conditions[J]．Hum Reprod,l998,13:2874-2879.

［2］ 王俊霞,朱桂金,魏玉兰,等.应用胚胎玻璃化冷冻技术获得临床妊娠及分娩1例[J]．中华妇产科杂志,2004,39(2):143.

［3］ 中华医学会，编著.辅助生殖技术和精子库临床技术操作规范[M]．北京：人民军医出版社，2010:50-51.

［4］ KASAI M,ZHU SE,PEDRO PB,e tal.Fracture damage ofembryosand its prevention during vitrification and warming[J]．Cryobiology,2009,33(4):459-464.