16种中药对水貂绿脓杆菌的体外抑菌试验

张传美，刘海生，杨海燕，杨瑞梅，秦志华，单 虎

（青岛农业大学动物科技学院，山东青岛266109）

绿脓杆菌（P.aeruginosa）或称铜绿色假单胞菌，为假单胞菌属（Pseudomonas）成员，是临床上较常见的条件致病菌之一，可引起各种继发或混合感染，亦可作为原发性病原引起水貂、家禽、兔、羊等动物发病。近几年来，随着养貂规模的扩大，临床上由绿脓杆菌引起的水貂出血性肺炎日益增多。绿脓杆菌具有多重耐药的特性，加之临床上抗生素的滥用，绿脓杆菌耐药的问题日益严重［1］。因此，兽医临床急需寻找低毒有效的抗生素的替代品，以控制疾病的发生。许多研究表明，中药或天然植物提取物，可发挥对病原菌直接杀灭作用或提高机体免疫力达到防治疾病的目的［2-3］。为此，本试验对五味子等16种中药，通过抑菌试验研究其对绿脓杆菌标准株和分离株的抑菌效果，旨在筛选出对绿脓杆菌有抑菌作用的药物，指导临床合理用药。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 中药 五味子，诃子，五倍子，石榴皮，乌梅，黄芪，太子参，金银花，连翘，黄连，射干，穿心莲，贯众，大黄，苍术，丁香。每味药50g，均购自青岛市城阳区同仁堂药店。

1.1.2 菌种 绿脓杆菌标准株ATCC27853为山东省农业科学院惠赠；分离株为山东省预防兽医重点实验室从临床发病水貂分离鉴定保存。

1.1.3 培养基 LB液体培养基，普通营养琼脂。

1.2 方法

1.2.1 菌种的培养 取冰箱中的绿脓杆菌标准株和分离株的菌种用普通琼脂培养，接种后置于37℃培养箱中培养，待菌种复壮后接种于LB液体培养基。培养6h后，按照1∶10 000稀释。

1.2.2 药液的制备 取16种中药各50g，浸泡30min，取各药分别水煎2次后浓缩。生药含量为1 000mg／mL，然后进行倍比稀释。灭菌后置冰箱备用，具体方法参见文献［4］。

1.2.3 抑菌试验 采用琼脂平板打孔法［5］，普通营养琼脂20mL倾注入直径9cm的平皿内，凝固后其厚度为4mm～5mm，用移液枪吸取200μL的细菌稀释液，均匀涂布于琼脂表面，待菌液被吸收后，用直径为6mm的无菌打孔器均匀打孔，5孔／板。孔间距大于20mm，依次滴加中药倍比稀释液，中间孔加入灭菌蒸馏水作对照。以刚刚注满为准，每种中药作2个重复。将平板37℃培养12h～18h后，用游标卡尺测量抑菌圈直径。以2孔的平均值表示该中药的抑菌作用大小。

1.2.4 判断标准 抑菌效果判定标准均按《中药药理学》标准即：抑菌圈直径＜10mm为耐药（-）。10mm～15mm为中度敏感（＋），15mm以上为高度敏感（＋＋）。

2 结果

2.1 16种中药对绿脓杆菌标准株的抑菌效果

采用打孔法测定了16种中药对绿脓杆菌标准菌株的抑菌圈直径，结果见表1。由表1可见，五倍子对绿脓杆菌标准株的抑菌效果最好，1 000 mg／mL浓度的药液抑菌圈直径达26.5mm。五味子和诃子也有较好的抑菌作用，1 000mg／mL浓度抑菌圈直径达23.5mm。其次为石榴皮、乌梅和黄连，对绿脓杆菌标准株也有一定抑菌作用。射干、连翘和金银花抑菌效果较差，抑菌圈直径均小于10 mm。穿心莲、贯众、黄芪、太子参、大黄、苍术、丁香7味中药各稀释度对绿脓杆菌标准株抑菌圈直径均为0，无抑菌作用（在表1中未列出）。

表1 16种中药对绿脓杆菌标准株的抑菌效果Table 1 Bacteriostatic effect of 16kinds of traditional Chinese medicines on standard strains of P.aeruginosa

2.2 16种中药对绿脓杆菌分离株的抑菌效果

采用打孔法测定了16种中药对绿脓杆菌分离菌株的抑菌圈直径，结果见表2。由表2可见，诃子对绿脓杆菌分离株的抑菌效果最好，1 000mg／mL浓度的药液抑菌圈直径达24mm。其次为五倍子和五味子，1 000mg／mL浓度的药液抑菌圈直径达21mm。黄连、石榴皮、乌梅、金银花和连翘对绿脓杆菌分离株也有一定抑菌作用。大黄和射干抑菌效果较差，抑菌圈直径均小于10mm。黄芪、太子参、穿心莲、贯众、苍术、丁香6味中药各稀释度对绿脓杆菌分离株抑菌圈直径均为0，无抑菌作用（在表2中未列出）。

表2 16种中药对绿脓杆菌分离株的抑菌效果Table 2 Bacteriostatic effect of 16kinds of traditional Chinese medicines on separation strains of P.aeruginosa

3 讨论

水貂出血性肺炎是由绿脓杆菌引起的貂的一种急性败血性传染病，临床表现为呼吸困难、咯血、死前鼻孔流出红色泡沫性液体，剖检病变主要在肺部，肺肿大，呈深红色肝样变，切开时流出大量血样泡沫，肺门淋巴结肿大，气管和支气管黏膜呈桃红色等。近年来，绿脓杆菌感染已渐趋增多，且耐药菌株不断增加。因此，从天然药物中寻找高效的抗菌药物就更显重要。五倍子、五味子、诃子、石榴皮和乌梅5味中药均为敛肺涩肠药，具有敛肺止咳、生津敛汗、涩肠止泻的功效［6］，故用五倍子等收涩药来治疗水貂的出血性肺炎符合中医治疗疾病的理论［7-8］。本试验证明五倍子、五味子、诃子、石榴皮和乌梅5味中药对绿脓杆菌有相当好的杀菌效果，其中五倍子、诃子和五味子中药在浓度很低的情况下，也会对绿脓杆菌产生抑菌效果，并且中药还不易产生耐药性，这些都为临床上中药治疗水貂绿脓杆菌病提供强有力的科学依据［9］。试验药物中，黄连、金银花、连翘和射干等清热类中药也有一定抑菌效果，黄芪和太子参等补益类中药以及穿心莲、贯众、苍术、丁香和大黄均无抑菌作用［10］。这表明补益类药物的抑菌作用不如清热解毒类药物。此试验与陈娟等［11］的试验结果相似。本试验仅通过抑菌试验对16种中药的药效进行比较，究竟疗效如何，还有待于实际临床进一步验证。

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