液态甲醛对雄性小鼠生殖毒性的研究

李亚琳

（渭南师范学院化学与生命科学学院，陕西渭南714000）

甲醛（formaldehyde）是一种无色、有刺激性气味的 气体，是重要的化工原料和有机溶剂，广泛用于制造树脂、塑料、橡胶、染料和油漆等。由于甲醛挥发度低，易从家具与装饰材料中缓慢释放而污染室内空气，经呼吸道进入人体，并对机体健康产生各种危害［1］。室内装修中使用含有污染物的劣质建筑装饰材料，使居民的室内空气也受到了严重的污染［2］，而且已成为危害公共健康的重要环境因素之一。甲醛作为一种常见的装修型化学性室内空气污染物，以其来源广，污染水平高，持续时间长，毒性大，毒害作用种类繁多等特点，受到人们的广泛关注，世界卫生组织（WHO）已将甲醛列为A1类化合物——人类致癌物［3］。甲醛对动物染毒的试验研究表明，甲醛引起的危害是多方面的，如致雄性小鼠的DNA单链断裂、染色体异常、姐妹染色体交换、基因突变、呼吸道和眼部刺激作用、致敏作用和免疫毒性、遗传毒性［4-5］，并能导致癌症、肺及肝功能损害、神经行为改变等［6-7］。随着对甲醛的广泛使用，关于甲醛污染对人体造成的危害已经引起人们的高度重视。

本试验将采用液态甲醛染毒的方法，通过给小鼠腹腔注射不同浓度的甲醛溶液，观察小鼠行为变化，测定小鼠睾丸的脏器系数、精子总数、精子存活率，并通过组织切片观察生殖系统的病理变化，来探讨甲醛对成年雄性小鼠生殖系统的毒性效应，为研究甲醛引起的人类疾病提供一定的试验资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 成年雄性小鼠，体重为25g±2g，购于第四军医大学实验动物中心，自由饮水和进食。

1.1.2 试剂 生理盐水，福尔马林溶液，700、800、950mL／L乙醇，无水乙醇，二甲苯，伊红，苏木精，蛋白甘油，盐酸乙醇，切片石蜡，中性树胶。

1.1.3 仪器 移液枪，恒温水浴箱，电子分析天平，切片机，显微镜等。

1.2 方法

1.2.1 分组 雄性小鼠16只，试验前先观察1周，然后随机分成4组，包括对照组和3个染毒组，每组4只。

1.2.2 染毒方法 在无菌条件下，用生理盐水配置成不同浓度的甲醛溶液，其浓度分别为2、20、200 mL／kg，临用时配制。用不同浓度的甲醛溶液腹腔注射染毒，给药量为每只小鼠0.1mL，对照组腹腔注射等体积的生理盐水。每天上午10：00注射1次，持续3周，同时观察行为变化。

1.2.3 行为的观察 每日观察并记录小鼠的饮食变化，外观体征，行为活动，粪便性状。

1.2.4 睾丸脏器系数的测定 每组小鼠脱颈椎处死后称其体重，并迅速取出睾丸，用电子天平准确称重并记录。计算睾丸脏器系数。脏器系数=睾丸质量（mg）／小鼠体重（g）。

1.2.5 精子悬液的制备 颈椎脱臼处死小鼠后，立即取出附睾，用预温的37℃生理盐水冲洗2次，用眼科剪纵向剪开附睾，置于加有3mL 37℃的生理盐水的试管中，在恒温箱中孵育20min，使精子充分游离。

1.2.6 精子的存活率 取出一定量的精子悬液，与等体积的伊红迅速充分混匀，使其染色后，取出10μL加入红细胞记数板中，400倍镜下观察一个视野中的精子存活情况，活细胞染成红色，死细胞为无色（镜下观察为透明）。精子存活率=活精子数／（活精子数＋死精子数）×100%。

1.2.7 生殖系统的病理观察 睾丸形态的肉眼观察：将各组雄性小鼠脱颈椎处死后，取出两侧睾丸，并观察颜色及形态的变化。

精子畸形变化的观察：按照以上的精子观察的方法，计数精子数量并观察不同染毒组的小鼠精子的形态变化。

睾丸组织形态观察：将各组雄性小鼠脱颈椎处死后，取睾丸，立即放入100mL／L的福尔马林溶液中固定，梯度乙醇脱水，透明后常规石蜡包埋，间断均匀切片5张～10张，切片厚度为7μm，苏木精-伊红（HE）染色，光镜下观察组织形态变化。

1.2.8 统计学分析 表中数据代表4次重复试验的平均值（±sD），结果用双样本t检验分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 行为的变化

液态甲醛染毒后可以引起小鼠的食量减少，饮水量减少；初期，小鼠有抓嘴、抓鼻、挠耳朵等行为，随后小鼠出现高度兴奋、躁动不安、站立，攀爬等行为；最后，出现群聚、懒惰、个别的鼠则出现走路拖曳、摇摆等现象，并且高浓度组中有几只小鼠有毛发缺少光泽，粪便不成形且变成黄白色等现象。

2.2 睾丸的脏器系数

由表1表明随染毒剂量的增加，睾丸的脏器系数呈降低趋势。与对照组相比，低剂量（2mg／kg）组具有显著性差异（P＜0.05），而中剂量（20mg／kg）组与高剂量（200mg／kg）组差异极显著（P＜0.01）。

表1 甲醛对睾丸脏器系数的影响Table 1 Effect of formaldehyde on testicle organ coefficient

2.3 精子总数、存活率

由表2表明随着染毒剂量的增加，精子总数逐渐减少，精子存活率逐渐降低。与对照组相比较，低剂量组具有显著性差异（P＜0.05），而中、高剂量组差异极显著（P＜0.01）。

表2 甲醛对精子存活率的影响Table 2 Effect of formaldehyde on survive rates of the sperms

2.4 生殖系统的病理观察变化

2.4.1 精子畸形的观察 在400倍显微镜下观察精子的头部、体部和尾部的形态变化，出现双头状、香蕉状、无定形状、肥胖以及双尾、无尾、尾巴折叠等现象，这些精子均为畸形的精子，并随染毒剂量的增加，精子畸变程度显著升高，畸形的精子数量也逐渐增加。

2.4.2 肉眼观察 经过解剖后，取出两侧睾丸观察其颜色变化，对照组的颜色白色而有光泽；低浓度组与对照组接近；而中、高浓度组的颜色泛黄而无光泽，且表面可见红色的毛细血管。

2.4.3 组织形态观察 对照组小白鼠的睾丸生精小管内生精细胞丰富，层次分明，发育正常，管腔内有许多精子，分布于支持细胞顶端（图1A）；低剂量组的各阶段生精细胞基本正常，与对照组没有显著差异，但有部分细胞稀疏、变性、脱落，个别的小管内可见精子出现水肿（图1B）；中剂量组小鼠睾丸病变进一步加重，出现广泛性的生精细胞层次稀疏，生精细胞明显水肿，生精细胞及支持细胞变性、坏死、脱落，小管内可见个别变性水肿的精子（图1C）；高剂量组睾丸生精细胞层崩解减少，生精细胞广泛脱落，小管内生精上皮大多数水肿或皱缩，个别小管内未见精子，仅见残存的支持细胞（图1D）。

3 讨论

甲醛具有毒性，能对小鼠的生理及行为产生一定的影响，且甲醛溶液的浓度越高，染毒时间越长，其效果越明显［8-9］。小鼠的行为变化与小鼠机体的生理活动和神经支配有密切的联系，有试验已经证明，当给小鼠注射甲醛溶液后，溶液渗入机体并对机体产生毒性效应，机体会通过周围神经和中枢神经的相互作用而发出相应的信号，从而支配相应的行为变化［10］。本试验通过对小鼠腹腔注射甲醛溶液后观察其行为的变化，染毒后，小鼠的食量、饮水量均减少，由高度兴奋、躁动逐渐变为群聚、懒惰，最后出现走路拖曳、摇摆等行为。

甲醛对雄性小鼠的生殖器官有毒害作用，染毒后甲醛进入并作用于睾丸组织，对睾丸的生长及生理活动产生影响，从而造成睾丸组织的病理性变化，造成睾丸萎缩而使脏器系数降低［11-12］。本试验研究表明随着染毒剂量的升高，甲醛对小鼠生殖器官的毒性也增大，睾丸的脏器系数也变小，说明甲醛使小鼠睾丸发生了不同程度的萎缩。

成年雄性小鼠的正常精子的产生、分化及成熟有赖于睾丸的生精细胞、支持细胞和间质细胞之间的密切协调，并受到下丘脑-垂体-性腺轴的控制，其中的任一环节出现障碍时，都会使生殖系统发生障碍。生精小管（seminiferous tubule）是精子的发生地，主要由生精上皮构成，生精上皮由支持细胞和生精细胞构成。成年的雄鼠生精细胞不断发育为精子，其顺序为精原细胞-初级精母细胞-次级精母细胞-精子细胞-精子。生精细胞沿着生精小管的管腔由内向外依次排列，睾丸间质是生精小管之间的富含血管的疏松结缔组织，生精小管与血液之间存在血-睾屏障，血睾屏障能阻止某些物质进入生精上皮，从而维持精子形成的微环境，而支持细胞主要为生精过程提供营养、分泌激素等，同时也是生精细胞的附着场所。当给小鼠腹腔注射甲醛溶液时，毒物会通过血液渗入睾丸组织，进而破坏了血-睾屏障，进入生精小管，破坏了生精细胞的正常生长发育过程，同时，支持细胞的功能也受到了阻碍，从而出现生精细胞层次减少、稀疏、脱落的现象，支持细胞也变性、坏死、脱落，整个过程将影响了精子的发生，从而使精子数量减少［13］，并引起睾丸细胞DNA的损伤［14］。本试验研究表明，经过染毒后的小鼠睾丸组织发生病变，低浓度组的睾丸组织的生精细胞稀疏，中浓度组的变性、坏死、脱落，精子出现水肿，高浓组的坏死、脱落，并且随着染毒剂量的增大，受损程度更加明显。

图1 不同浓度甲醛处理的睾丸组织病理切片观察（400×）Fig.1 Observation of testicle tissue section treated by different formaldehyde concentrations（400×）

足够的精子数量是维持正常生育力的重要前提，在评价有害因素对雄性生殖健康的影响时，精子数量的改变比其他指标更为敏感。精子计数是评价生殖毒性效应的重要指标，可反映生精细胞的功能［15］。本试验研究发现，小鼠经甲醛染毒后，随着染毒剂量的增加，各染毒组的精子数量、精子存活率均明显降低，与对照组比较有极显著性差异，表明甲醛能抑制精子的发生，干扰精子的形成和生长过程。

目前认为，精子形态由多基因遗传控制，常染色体上的基因控制精子畸形的类型，性连锁基因Y-基因控制畸形精子的数量，因此，精子畸形率的增加在一定程度上反映出雄性生殖细胞的遗传损伤。有研究已经发现甲醛能使精子畸形的数目增加，引起严重的生殖毒性作用［9，15］。本试验通过使小鼠染毒，并观察不同剂量组的精子畸形的变化，表明甲醛溶液染毒后能影响精子的形成及生长发育过程，使精子发生不同程度的畸变，并随染毒剂量的增加，精子畸变程度显著升高，畸形的精子数量也逐渐增加。

本研究通过甲醛腹腔注射使小鼠染毒，证明了甲醛能够渗透并作用于睾丸组织，造成生殖器官萎缩，影响雄性小鼠的生精过程，造成睾丸组织的病理损伤，使精子生成数目减少，同时对精子的成熟过程造成一定的影响，使精子形态发生异常改变，畸变精子数目增加，直接影响生殖系统正常功能的发挥。

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