鸭新城疫病毒单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA 方法的初步建立

孙敏华，董嘉文，吕殿红，周秀蓉，李林林，胡奇林

（广东省农业科学院兽医研究所 广东省公共卫生公共实验室，广东广州510640）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（NDV）引起的一种严重危害养禽业的急性高度接触性传染病。早在1971年，Higgins D A［1］在香港发现9起鸭新城疫病毒感染的急性病例，并分离出高致病性的NDV。而自2000年后，我国分离鉴定的绝大多数鸭新城疫病毒对鸭的致死率在50%以上，对鸡的致死率可高达100%［2-4］。其中，部分毒株与水禽新城疫病毒关系密切［5］。由于NDV宿主范围广泛，且目前高致病性毒株所占比例大，给养禽业带来了巨大的威胁。

目前，新城疫的确诊主要依靠病毒的分离鉴定，该法准确、特异，但相对费时费力。ELISA方法能进行批量检测、速度快，适合于基层兽医和动物检疫部门使用。1995年，吴红专等研制出新城疫单抗夹心ELISA试剂盒，临床样本的检测结果表明其阳性符合率达100%［6］。也建立了针对甲型H1N1流感病毒及鹿流行性出血病病毒的双抗体夹心ELISA方法［7-8］。鉴于此，本研究制备了抗鸭新城疫病毒单克隆抗体，建立了单抗夹心ELISA方法，为快速诊断鸭新城疫奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞系 1.5kg清洁级新西兰兔和6周～8周龄Balb／c雌性小鼠购自南方医科大学实验动物中心，骨髓瘤细胞SP2／0由华南农业大学郭霄峰教授惠赠。

1.1.2 试剂 HAT选择培养基、DMEM培养基为Gibco公司产品；HT培养基为Invitrogen公司产品；PEG 1450为Sigma公司产品；蛋白分子量标准Fermentas公司产品；胎牛血清为杭州四季青生物有限公司产品；HRP标记的羊抗鼠二抗为Proteintech公司产品；HRP标记的羊抗兔二抗和弗氏佐剂为鼎国生物有限公司产品；禽流感H5、H9标准阳性抗原为哈尔滨维科生物技术开发公司产品；ELISA反应板为Corning公司产品。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制备 鸭新城疫病毒由广东省农业科学院兽医研究所禽病研究室鉴定、保存。经尿囊腔接种于12日龄鸭胚，收集24h后死亡的鸭胚尿囊液，经差速和蔗糖密度梯度离心纯化，测定蛋白含量，保存于-70℃，用作免疫抗原和包被抗原。

1.2.2 ELISA筛选方法的建立 参照文献［9］选择6周龄雌性Balb／c小鼠进行免疫，采集血清。将Balb／c小鼠阳性血清和阴性血清均作倍比稀释，同时设立SP2／0细胞培养上清及空白对照，选择OD490nm值在1.0左右，P／N比值最大的抗原稀释浓度为最适工作浓度。

1.2.3 单克隆抗体及腹水的制备、筛选和鉴定 按照常规方法融合［9］，用ELISA方法筛选阳性克隆，进行亚克隆及腹水制备。制备鸭胚成纤维细胞，参考文献［9］进行单抗中和活性的测定。取细胞培养上清单克隆抗体，按照 Mouse MAb Isotyping Kit（Hycult Biotech）说明书进行亚类鉴定。测定单抗亚类后，用间接ELISA方法测定腹水效价。

1.2.4 单克隆抗体的特异性 将传染性支气管炎病毒 （IBV）、禽 呼 肠病毒 （ARV）、鹅 细 小病毒（GPV）、鸭肝炎病毒（DHV）、鸭瘟病毒（DPV）、NDV LaSota株、F48E9株尿囊液以及禽流感H5、H9标准阳性抗原按1∶10稀释后包被ELISA反应板，应用ELISA方法进行测定。

1.2.5 双抗体夹心ELISA方法的初步建立及其特异性、敏感性和重复性试验 用PEG沉淀法［10］对2C1腹水进行纯化；用辛酸-硫酸铵沉淀法［11］对兔抗鸭新城疫病毒血清进行纯化，测定蛋白含量，用SDS-PAGE鉴定纯度。分别以纯化的单抗和多抗为包被抗体，进行双抗体夹心ELISA，以确定最佳包被抗体。以方阵法确定抗体、抗原最佳工作浓度、作用时间等。特异性试验是以DPMV尿囊液作为阳性对照，正常鸡胚、鸭胚尿囊液为阴性对照，对IBV、ARV、GPV、DHV、DPV 的尿囊液及 H5、H9标准阳性抗原进行ELISA检测。敏感性试验是将DPMV尿囊液作1∶5～1∶5 120稀释，分别测定其血凝活性及ELISA效价，以确定该方法的敏感性。重复性试验是将DPMV阴、阳性尿囊液分别按1∶10、1∶20稀释，各做3个重复，统计数据计算批内变异系数；在不同时间重复3次该试验，统计数据计算批间变异系数。

1.2.6 双抗体夹心ELISA方法检测临床样品时阴阳性判定标准的确定 以双抗体夹心ELISA方法检测30份NDV非免疫鸡的泄殖腔拭子样品，根据统计学原则，样本的OD490nm值＞阴性样本OD均值（¯X）＋3×SD时，可以在99.9%的水平上判定为阳性。

1.2.7 人工感染样品的检测 取DPMV尿囊液1∶10稀释后人工滴鼻感染3只6周龄SPF鸡，每只0.2mL。分别于感染后1d～7d，采集对照组和感染鸡的泄殖腔拭子于2mL PBS中，挤压拭子后，5 000r／min离心5min，取0.1mL上清用ELISA方法检测，同时平行取0.3mL上清用双抗处理后，接种SPF鸡胚制备的成纤维细胞单层进行病毒分离，每份样品接3孔细胞，每孔0.1mL。病毒鉴定采用血凝和血凝抑制试验。

2 结果

2.1 抗原的制备

感染鸭胚尿囊液经高速离心沉淀，蔗糖密度梯度纯化，取出40%～60%之间的白色病毒层，脱糖后，将沉淀溶于3mL PBS中，紫外分光光度计测得病毒的蛋白含量为6.52mg／mL。

2.2 单克隆抗体的筛选及其特性测定

当包被的病毒量为0.8μg／孔，阳性鼠血清1∶800稀释，羊抗鼠二抗1∶10 000倍稀释时，P／N比值最大，且阳性值最接近1.0。因此，选择该条件下的抗原包被量和二抗作用浓度来筛选单克隆抗体。细胞融合后，经ELISA筛选，选取P／N＞3.0的细胞孔，用有限稀释法克隆3次后，获得一株稳定的杂交瘤细胞株，命名为2C1。特异性试验表明，2C1不与IBV、ARV、GPV、DHV、DPV尿囊液以及禽流感H5、H9标准阳性抗原发生交叉反应，但与新城疫病毒La Sota株、F48E9株尿囊液发生反应；中和试验结果表明，该株单抗没有中和活性；抗体亚类鉴定表明，该单克隆抗体重链为IgM，轻链为κ链（图1）。杂交瘤细胞株2C1所制备的腹水ELISA效价大于1∶64 000。

图1 单克隆抗体2C1亚类鉴定结果Fig.1 Subtype identification of monoclonal antibody 2C1

2.3 双抗体夹心ELISA方法的初步建立

2C1腹水用120g／L的PEG6000溶液沉淀两次。兔抗NDV血清经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化、透析、离心后，与纯化前的腹水和多克隆抗体进行SDS-PAGE后发现，纯化后的抗体在凝胶中均呈现出重链和轻链两条特异性的条带，且大小与预期相符（图2）。ELISA试验表明，以纯化后的2C1腹水作为包被抗体，兔抗DPMV多克隆抗体为第二抗体，其P／N值高，且阴阳性区别明显。方阵试验结果表明，当纯化后的单抗包被量为4μg／孔，鸭副黏病毒尿囊液1∶10稀释，兔抗鸭副黏病毒多克隆抗体浓度为0.1μg／孔，HRP标记的羊抗兔二抗1∶10 000倍稀释，每种组分作用1h时，P／N值最大，条件最优。

图2 单抗2C1及抗NDV兔血清纯化前后SDS-PAGE电泳比较结果Fig.2 The comparison of SDS-PAGE results of the unpurified and precipitated monoclonal antibody 2C1and polyclonal antibody against duck NDV

2.4 双抗体夹心ELISA方法特异性、敏感性和重复性的确定

在最佳工作条件下，IBV、ARV、GPV、DHV、DPV的尿囊液以及禽流感H5、H9标准阳性抗原的OD490nm值最高为0.122，与阴性对照的比值小于2，特异性良好（表1）。倍比稀释后的尿囊液HA效价为1∶10，ELISA效价（按P／N＞3.0计算）为1∶640，因此判定ELISA方法敏感性至少比HA高64倍（表2）。纯化的鸭副黏病毒稀释后，ELISA至少可以检测到0.2μg的病毒（表3）。重复性试验表明，两个稀释度抗原的批间重复变异系数为5.22%～9.15%，批内重复的变异系数为2.03%～5.34%。

2.5 双抗体夹心ELISA方法检测临床样品时阴阳性判定标准的确定

30份未免疫新城疫疫苗的鸡泄殖腔拭子ELISA检测平均OD值为0.130，标准差为0.038，计算可得，当样品的OD490nm值大于0.244时，可判定为阳性。

2.6 人工感染样品的检测结果

根据ELISA阴阳性判定标准判定，1号鸡第4天和第5天拭子检测结果为阳性；2号鸡无阳性结果；3号鸡攻毒后第3、第4、第5天检测结果阳性。这些ELISA阳性检测结果中，1号和2号的检测结果与病毒分离相符合，而第3号鸡攻毒后的第3天和第6天检测结果与病毒分离不符。综合计算，ELISA检测结果与病毒分离的总符合率为91.7%（表4）。

表1 双抗体夹心ELISA特异性检测结果Table 1 The specificity of the sandwich ELISA

表2 HA和双抗体夹心ELISA检测鸭新城疫病毒结果比较Table 2 The results of HA test and the sandwich ELISA for detecting the duck NDV

表3 双抗体夹心ELISA方法敏感性试验Table 3 The sensitivity of the sandwich ELISA

表4 人工感染样品ELISA检测结果Table 4 The detective results of experimentally infected chickens by sandwich ELISA

3 讨论

本研究采用蔗糖密度梯度离心法纯化了鸭新城疫病毒，利用淋巴细胞杂交瘤技术，获得了一株抗鸭新城疫病毒单克隆抗体2C1的杂交瘤细胞株。单抗筛选采用了全病毒包被的间接ELISA方法，扩大了筛选范围。2C1经中和试验后，发现其不具有中和活性，因此在后续制备具有中和活性的单抗时用HI试验筛选可能会获得理想的结果。经ELISA检测，2C1腹水的ELISA效价大于1：64 000，且与其他禽类病毒无交叉反应，证明其特异性良好，可以用于后续夹心ELISA方法的建立。单克隆抗体亚类鉴定结果表明2C1的重链为IgM。由于IgM通常以五聚体的形式存在，且容易聚集，在高盐和低盐溶液中溶解度都不高，因此纯化方法有别于IgG。Mahassni S H等［13］研究发现，细胞培养上清中抗牛凝血素的小鼠IgM单抗最佳的纯化方法是离子交换层析，而腹水中的最佳纯化方法是G-100凝胶过滤。曹军平等［10］研究发现利用PEG6000沉淀法纯化的单抗较纯净，且活性损失少。综合成本和时间因素，本研究选用PEG沉淀法进行2C1腹水的纯化。而鸭新城疫病毒多克隆抗体的纯化，本研究参考 McKinney M M 等［11］和曹军平等［10］的研究，选择了辛酸-硫酸铵法进行了纯化。对纯化前后的样品进行SDS-PAGE（图2），结果显示纯化效果良好，去除了杂蛋白，且重链和轻链分子量大小符合预期。

在选择夹心ELISA中的包被抗体时，用纯化后的腹水2C1和纯化的鸭新城疫病毒多克隆抗体分别包被酶标板，进行ELISA预试验。结果表明，当2C1作为包被抗体，抗鸭新城疫病毒多克隆抗体作为第二抗体时，才能获得较高的P／N值。方阵试验表明，当2C1包被浓度为4μg／孔，鸭新城疫病毒尿囊液1∶10稀释，抗鸭新城疫病毒多克隆抗体作用浓度为0.1μg／孔，HRP标记的羊抗兔酶标抗体1∶10 000倍稀释，每种成分作用1h时，P／N比值最高。特异性试验表明所建立的鸭新城疫病毒检测方法不与IBV、ARV、GPV、DHV、DPV 发生交叉反应。该ELISA方法比传统HA试验方法至少敏感64倍，可以检测出0.2μg的纯化病毒。吴红专等［6］研 制 的 PEG-ELISA 试 剂 盒 的 敏 感 性 为0.25ng～0.5ng的纯化病毒，比本研究的结果高出800倍，这可能与单抗亲和力及PEG具有沉淀免疫复合物的作用有关。因此，高亲和力的单抗是试剂盒研制成功的关键。

小样本人工感染样本检测结果表明，本研究所建立的夹心ELISA方法与病毒分离的符合率为91.7%。由于所取样本有限，后续试验需扩大样本检测数量，以便评价本研究建立方法的实用性。ELISA和病毒分离的结果表明，感染后的SPF鸡排毒高峰在3d～5d，这与文献报导类似［14］。由于双抗体夹心ELISA试验中参与反应的成分多，非特异性反应很难完全消除。本研究在检测含大量粪便的拭子时，ELISA检测结果存在偏高的现象，其原因尚待进一步研究。目前，能够进行鉴别诊断的单抗夹心ELISA方法尚不多见［6，15］，且 ELISA 呈阳性者不全是强毒力株，还有中等毒毒力株或弱毒力株［16］。因此，鉴别诊断ELISA方法是今后研究的重点。

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