TA方案对乳腺癌敏感率与DNA修复酶表达的相关性研究Δ

张晓丽 ，李海峰，李建锋，刘开扬#，马燕娜，杜，张鑫雨（.河北北方学院生命科学研究中心，河北张家口 07509；.河北北方学院法医教研室，河北张家口 07509；.河北北方学院大学生科协，河北 张家口07509）

化学治疗是乳腺癌综合性治疗的一部分，目前紫杉醇（Taxol，T）联合阿霉素（Adriamy，A）方案在临床有比较广泛的应用，而疗效高低报道不一致，临床普遍认为癌细胞对药物的敏感性与生物学特性有关。本试验通过免疫组化染色及原代癌细胞培养技术，观察并分析了83例乳腺癌中DNA修复酶O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）的表达与癌细胞对TA方案敏感率的关系。

表1 乳腺癌MGMT表达率及其他乳癌对TA方案的敏感率Tab 1 MGMT expression rate of breast carcinoma and susceptibility rate of breast cancer to TA scheme

表2 MGMT表达与TA方案敏感率的关系Tab 2 Relationship between MGMT expression and high sensitivity of TA scheme

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2004年9月－2006年7月河北北方学院第一附属医院乳腺癌切除标本83例，均为女性，年龄31～73岁，平均49.3岁。

1.2 仪器与试药

5430型全自动二氧化碳（CO2）孵箱；DG-3022型酶标检测仪（λ＝490 nm）；双人超净工作台；96孔无菌培养板。

RPMI 1640培养液（美国GIBCOBRL公司）；小牛血清（上海伯奥生物科技公司）；二苯基溴化四氮唑盐（美国SIGMA公司）；二甲基亚砜（DMSO）。抗癌药物：TA方案（紫杉醇+阿霉素）。药物使用的终浓度取临床药物血浆峰浓度的1/10（药物浓度（μg·mL－1）＝60×D/5000÷50%×103。式中，D为临床用药剂量，单位为mg·kg－1；60为平均成人体重，单位为kg；50%为血细胞体积，单位为mL；乘以103后将mg换算为μg），计算得每毫升紫杉醇为960 μg，阿霉素为1.5 μg。免疫组化药物：兔抗人MGMT多克隆抗体和SABC（（Strept avidin-biotin complex））试剂盒（武汉博士德生物技术公司）；DAB显色剂（北京中杉金桥公司）。

1.3 方法

将乳腺癌组织标本置1640培养液送检，2 h内开始试验，分离癌细胞并计数，取含5×105个/100 μL的癌细胞悬液放入37℃、5%CO2培养箱培养4 h，加入化疗药物作用24 h后，每孔加入MTT 20 μL，4 h后弃上清液，每孔加DMSO 100 μL，10 min后检测光密度（OD）值，波长选择490 nm，并计算抑制率（IR）：

IR＝1－（加药OD－不加药OD）/不加药OD×100%

免疫组化染色程序按试剂盒规程操作，微波进行抗原修复。阳性对照为已知阳性切片，阴性对照以PBS缓冲液代替Ⅰ抗。

1.4 判定标准

参考其他研究[1]，IR＞50%者为高敏感病例；IR为30%～50%者为敏感病例；IR＜30%者为不敏感病例；（高敏感病例+敏感病例）/总病例×100%＝总敏感率。MGMT阳性物为棕黄色，分布于细胞质。在一张切片上取10个低倍视野。其中，阳性细胞＞15%为阳性病例，＜15%为阴性病例。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用四格联列表法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在乳腺癌中MGMT阳性（+）率为55.42%（46/83），TA方案敏感率为42.17%（35/83）。在不同病理类型中MGMT的表达组间比较无显著性差异（P＞0.05），MGMT表达与淋巴结是否发生转移有相关性，MGMT高表达与TA方案的敏感率呈低度相关（r＝0.23）。MGMT表达率及乳腺癌对TA方案敏感率和MGMT高表达与TA方案敏感率的关系详见表1、表2。

3 讨论

烷化剂是环境中普遍存在的一种致突变和致癌物质，其作用于DNA后，形成O6-烷基鸟嘌呤化合物。如果组织中MGMT异常，不能发挥正常作用或作用不足时，O6-甲基鸟嘌呤不能被及时移走，在DNA复制中，该化合物与胸腺嘧啶错配，发生G：C→A：T突变（鸟嘌呤：胞嘧啶错配为腺嘌呤：胸腺嘧啶），导致癌基因激活和抑癌基因失活，进一步导致肿瘤发生[2，3]。人类MGMT基因定位于10q26上，全长约170 kb，是一种普遍存在的DNA修复酶，可将烷化剂在鸟嘌呤O6位形成的加合物移除，使存在DNA损伤的细胞不再增殖，从而保持基因组的完整性[4]，所以MGMT表达阳性的患者对烷化剂类化疗药物敏感。提示MGMT的检测对于临床化疗药物的选择具有指导意义。本试验中MGMT的阳性率为55.42%（46/83），并有淋巴结转移组MGMT的阳性表达率明显高于无淋巴结转移组（P＜0.01），但在不同病理类型组中，MGMT表达无显著性差异（P＞0.05）。

烷化剂的药理作用是通过释放活泼的烷化基团，使DNA鸟嘌呤第6位氧原子烷基化，O6-AG不能与胞嘧啶配对，而与胸腺嘧啶共价结合，形成具有高度细胞毒性的DNA交链，影响DNA复制，导致细胞死亡。而MGMT可使6-RG的烷基基团转移到自身的半胱氨酸残基上，对烷化剂导致的DNA损伤具有修复作用，影响了烷化剂类化疗药物疗效。在肿瘤治疗方面，MGMT拮抗药能明显逆转肿瘤对烷基类药物的耐药性，增加烷基类药物疗效。如何调控MGMT表达以达到最佳化疗效果，是目前肿瘤治疗中较感兴趣的问题。MGMT基因多态性与肿瘤发生及治疗、预后的关系也将是今后该领域研究另一重要方向。

紫杉醇是1963年从太平洋西岸的短叶紫杉树中发现对许多肿瘤细胞有细胞毒性作用的天然物质。紫杉醇是一种新型抗微管药物，其作用机制主要是促进微管蛋白的聚合，抑制微管的解聚，阻断细胞周期M期和G期，从而阻止肿瘤细胞的增殖。近年来临床研究[5～8]报道用紫杉醇单药治疗乳腺癌、肺癌、胃癌等，取得了良好成效。阿霉素为蒽环抗菌类化疗药物，对增殖细胞各期和G0期细胞都有作用，为细胞周期非特异性抗肿瘤药物（CCNSA）。阿霉素抑制DNA合成的作用机制为：与DNA结合，作用于有丝分裂前期，从而抑制核酸合成和有丝分裂，诱导细胞死亡；自由基生成；与金属离子结合；与细胞膜结合[9，10]。TA联合方案，不仅使癌细胞分裂受阻，而停滞在G2期和M期，同时阿霉素阻断（或抑制）DNA复制和RNA转录作用，导致细胞增殖停滞[11，12]，起到抗肿瘤作用。

本试验显示，乳腺癌患者对TA方案的总敏感率为42.17%（35/83），在46例MGMT阳性患者中，有24例对TA化疗方案敏感，22例患者不敏感，通过四格联列表法可知MGMT高表达与TA方案抑制率呈低度相关（r＝0.23），提示检测MGMT在乳腺癌中的表达可以预测TA方案的敏感率。

本研究结果表明，乳腺癌细胞中MGMT的表达水平可以预测TA方案对乳腺癌的治疗效果。因此，检测乳腺癌中MGMT的表达状况对于临床化疗方案的选择有一定指导意义。

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