气相色谱法检测牛奶中脂肪酸组分方法的改进

李云龙，杨章平，常玲玲，冀德君，王小龙，甘宗辉，刘 姗，刘贤慧

（扬州大学动物科学与技术学院，江苏 扬州 225009）

牛奶中脂肪酸主要是甘油三酯，此外还含有少量磷脂和甾醇。脂肪酸主要分为三类：第一类为水溶性挥发性脂肪酸，如丁酸、乙酸等；第二类为非水溶性挥发性脂肪酸，如十二碳酸等；第三类是非水溶性不挥发性脂肪酸，如十四碳酸等［1］。牛乳脂肪中含有C20～C23的奇数碳原子脂肪酸，也发现有带侧链的脂肪酸。乳脂中的不饱和脂肪酸主要是油酸，约占不饱和脂肪酸总量的70%左右。乳脂肪的组成受饲料、营养、环境、季节等因素的影响［2］。一般夏季乳中不饱和脂肪酸含量升高，而冬季不饱和脂肪酸含量下降。

牛奶中脂肪酸的检测方法可以分为好几种，比较粗略的分析方法有紫外分光光度法和红外分析，根据光谱中吸收峰的位置和形状来推断未知物结构，依照特征吸收峰的强度测定各组分的含量［3，4］。近几十年来，银离子高效液相色谱（Ag＋－HPLC））广泛用于分离饱和度不相同的脂肪酸有效方法，流动相中添加银离子后，可降低带有不饱和双键化合物的保留时间。

Ag＋－HPLC能有效地完成共轭亚油酸甲酯顺、反几何异构体的分离［5］。目前，脂肪酸测定普遍使用气相色谱法（GC－FID），大多数科学研究人员也把GC－FID作为测定总脂肪酸含量的重要工具。极性毛细管柱的高溶解性，使得气相色谱法（GC）能顺利完成分析和定量的任务［6］。此外，气质连用方法（GC－MS）准确的分析不同脂肪酸所含的碳原子数，对同分异构体还能确定双键所在的位置，因此，如果采用适宜的衍生化方法，GC－MS是用于鉴定分析共轭亚油酸（CLA）异构体的非常有用的工具［7］。本研究建立了极性毛细管氢离子火焰检测方法（GCFID），用来检测牛奶中脂肪酸的组成和含量，为研究牛奶中脂肪酸的变化规律奠定技术基础。

1 材料与方法

1.1 样本的采集

采集扬大农牧场150头中国荷斯坦奶牛的奶样，奶样为早：中：晚＝4∶3∶3的混合奶样，－20℃冷冻保存，用于脂肪酸组成与含量的分析。

1.2 主要仪器和试剂

气相色谱仪为Agilent 7890A，c9，t11CLA甲酯和t10，c12CLA甲酯购自美国Matreya公司，37种脂肪酸混标和c18∶1trans－11（TVA）标准品购自Sigma公司。

1.3 本实验优化的脂肪酸气相色谱检测方法

脂肪酸的前处理参照GB／T21676－2008《乳与乳制品脂肪酸测定气相色谱法》［8］，采用 Agilent HP－88专用脂肪酸甲酯毛细管柱。气相色谱检测条件：进样口温度250℃，分流比20∶1，检测器温度260℃，载气为高纯度氮气，流速为1mL／min，采用程序升温步骤，初始温度140℃，保持5min，以6℃／min升温到200℃，保持20min，再以2℃／min升温到220℃，保持20min。

1.4 定性和定量方法

以保留时间定性，以面积百分比法定量。

2 实验结果

2.1 气相色谱检测结果

在上述优化的气相色谱检测条件下，先进样标准品，检测结果见图1，37种脂肪酸标准品、2种CLA标准品和TVA标准品得到很好的分离，再用同样的方法检测牛奶样品中脂肪酸的组成（图2），根据标准品中脂肪酸的保留时间可以定性，根据样品中脂肪酸的峰面积可以用面积百分比定量。表1所表示的是在牛奶中所检测到的各种脂肪酸的比例和变化范围。

2.2 样品的加标回收率测定

图1 脂肪酸甲酯标准品的气相色谱图

图2 原料乳脂肪酸色谱图

取0.5mL样品液（c9t11CLA浓度已知0.322 mg／mL）6份，浓度计为C1，分别加c9t11CLA标准液（c9t11CLA 0.5mg／mL）0.5mL，浓度记为 C2，作为加标样品液，组分含量为C，按上述GC检测条件测定加标样品液组分C的含量。回收率（%）＝C／（C1＋C2）×100%，结果见表2。平均回收率为99.588%，由此可见该方法检测具有很高的准确度。

2.3 精密度检测

平行测定样品6次，其测定结果的相对标准偏差见表3。可以看出此方法具有很好的重现性。

表1 原料乳中各脂肪酸含量及变化范围（M±SD）

表2 回收率测定结果

表3 精密度测定结果

3 讨论

在食物脂肪酸的分析技术中，样品预处理在整个分析过程中至关重要，其中样品预处理的一个主要方法就是使被测物生成衍生物的方法，而甲酯化方法是目前衍生化方法中最常用、最有效的方法［9］。Christie（1982）［10］的方法一直被认为是经典的甲酯化方法。卜登攀在乳脂分离和甲酯化方法上做了优化研究，共采用4种方法，结果表明：采用高速离心或者高速离心结合有机溶剂分离乳脂肪后采用酸碱甲酷化，不仅对于乳脂大部分常规脂肪酸组成没有显著的影响，同时能弥补乳脂肪提取时存在耗时、工作量大、环境污染、成本高和处理效率低的缺陷。王小静［2］采用离心加有机溶剂提取脂肪酸，用碱性方法甲醇－甲醇钠甲酯化后，进行气相色谱分析，测得的回收率为100.14%，精密度相对标准偏差RSD为3.77%。本研究采用国标 GB／T21676－2008的方法进行甲酯化，先用有机溶剂提取脂肪酸，再用氢氧化钾甲醇和三氟化硼进行甲酯化，甲酯化在95℃水浴锅中短时间进行，因为有研究表明甲酯化温度过低会造成甲酯化不完全，而长时间高温甲酯化又会产生异构体，影响检测结果［11］。本实验结果与王小静的结果相比较，在检出的脂肪酸种类上多出10种，有可能是所用的标准品脂肪酸种类含量较多，可以用于定性的脂肪酸种类相应增加，与卜登攀的实验结果较一致，只是在个别脂肪酸cis12C18∶1、C20∶4和C20∶5上有所区别。在GC分析时所选用柱子的类型和长度均对分析结果有很大的影响。柱子的固定相决定了柱子的性质和用途，柱子的长度决定了对物质分离的好坏，为了得到较好的分离效果，在本实验中，采用安捷伦Agilent HP－88极性非常强的脂肪酸甲酯测定专用毛细管柱是非常必要的［12］。此外，程序升温法在气相色谱检测中还是必要的，它可以按照组分沸点的不同连续地随时间线性或非线性逐渐升高，使柱温与组分的沸点相互对应，以使低沸点组分和高沸点组分在色谱柱中都有适宜的保留、色谱峰分布均匀且峰形对称。

总之，采用毛细管气相色谱一氢火焰离子化检测器测定乳脂中脂肪酸组成的方法具有样品前处理简单、耗用试剂少，灵敏度及回收率高，重现性好等诸多特点。该方法不仅可以做定性分析，还可以做定量分析，对于乳制品来源的其它脂肪酸含量的测定也具有指导意义，很适宜推广应用。

［1］ 周光宏.畜产品加工学［M］.北京：中国农业出版社，2002，177－178.

［2］ 王小静.调控反刍动物消化代谢提高乳脂中共轭亚油酸含量及其机理的研究［D］.南京农业大学，2007.

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［4］ Mossoba M M，McDonald R E，Prosser E R.GC matrix－isolation Fourier－transform infrared spectroscopic determination of trans－monounsaturated and saturated fatty acid methyl esters in partially hudrogenated menhaden oil［J］.Agric.Food Chem，1993（41）：1998－2002.

［5］ Delmonte P，Kataoka A，Cori B A，et al.Relative retention order of all isomers of cis／trans conjugated linoleic acid FAME from the 6，8－to13，15－positions using silver ion HPLC with two elution systems［J］.Lipids.2005，40（5）：509－514.

［6］ Kramer J K，Blaekadar C B，Zhou J Q.Evaluation of two GC columns（60－m SUPELCO WAX 10and l00mCP sil 88）for analysis of milk fat with emphasis on CLA，18∶1，18∶2and 18∶3isomers，and short－and long－chain FA［J］.Lpids.2002，37（8）：823－835.

［7］ Dobson G.Gas chromatography－mass spectrometry of conjugated linoleic acids and metabolites［J］.AOCS Press.20（3），2：13－36.

［8］ GB／T21676－2008《乳与乳制品脂肪酸的测定气相色谱法》.

［9］ 陈定一.分析化学（下册仪器分析）［M］.北京，学苑出版社，1995，165－173.

［10］ Christie W W.A simple procedure for rapid transmethylation of glycerolipids and cholesteryl esters［J］.Lipid Res，1982，23（7）：1072－1075.

［11］ John A G，Roach M M，Mossoba M.chromatographic separation and identification of conjugated linoleic acid isomers［J］.Analytica Chimica Acta，2002，465（12）：207－226.

［12］ Banni S，Angioni E，Casu V，et al.Decrease in lionleic acid metabolites as a potential mechanism in caneer risk reduction by conjugated linoleic acid［J］.Carcinogenesis.1999，20（6）：1019－1024.