通经补肾复方对铝诱导阿尔茨海默病模型大鼠海马乙酰胆碱酯酶、胆碱乙酰转移酶、乙酰胆碱的影响

程书珍 王丽君 刘 恒 王晓梅 刘爱民 骆朋好 (河北工程大学医学院，河北 邯郸 05600)

Tomimoto等〔1〕研究表明，痴呆的首发症状是记忆障碍，中枢胆碱功能损伤对记忆功能的影响有重要意义。在对阿尔茨海默病(AD)的诸多研究中，胆碱能神经系统退行性改变的发病机制已被多数学者接受，但铝对AD模型大鼠胆碱能系统的影响报道较少。鉴于此，采用铝饲料喂饲大鼠制备AD动物模型，观察了铝摄入对大鼠海马组织中乙酰胆碱酯酶(AchE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)活性及乙酰胆碱(Ach)含量的影响，并研究了通经补肾中药复方对AD模型大鼠海马胆碱能神经系统的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 AlC13·6H2O，分析纯，天津双船化学试剂厂;ChAT和AChE测定试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供。大鼠乙酰胆碱ELISA试剂盒(美国Sigma);中药复方(通经补肾复方)由淫羊藿、熟地、黄芪、水蛭等组成，由河北省石家庄医药公司提供，生药经河北医科大学药学院生药教研室鉴定均为纯品。中药经浸泡、文火煎熬，每毫升生药含量为2.7 g，4℃冰箱保存，用前进行巴氏消毒。其他试剂均为国产，分析纯。UV－250型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)。电子天平(上海精天电子仪器有限公司产品)，TGL－16G台式高速离心机(上海安亭科技仪器厂)。

1.2 动物分组与处理 选用北京医科大学实验动物中心购得的体重(350±20)g健康清洁级3月龄 SD大鼠84只(合格证号SCXK－00－0004)。采用普通饲料适应性饲养1 w后，按体重随机分为7组，每组12只，其中对照组喂普通饲养，模型组及3个中药组在普通饲料的基础上，按体重8%的进食量添加A1C13·6H2O，剂量分别为:11.2、55.9、111.9 mg/kg 体重，喂饲铝饲料当天起，3个中药组用中药煎剂灌胃，剂量分别为:10.8、21.6，30.4 g·kg－1·d－1，各模型组、对照组大鼠每天灌服等量温开水。动物自由饮水，动物房温度(20±2)℃。

1.3 ChAT及AchE的活性、Ach的水平测定 上述实验到第90天时，大鼠禁食24 h，断头处死，快速取出全脑，置于冰盒上，分离海马并称重。按照重量和体积比1∶10的比例，加入生理盐水冰浴匀浆，4℃离心(3 000 r/min，10 min)，取上清液，立即测定。紫外可见分光光度法测定海马ChAT、AchE活性，其中蛋白测定采用考马斯亮蓝法，所有操作按试剂盒说明书进行。最后用紫外可见分光光度计测定各管吸光度，计算ChAT及AchE的活性。双抗体夹心法ELISA法测定海马Ach的水平。用纯化的大鼠ACh抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入ACh再与HRP标记的ACh抗体结合，形成抗体－抗原－酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的大鼠Ach含量呈正比。通过标准曲线计算样品中ACh浓度。

1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件，计量资料用±s表示，成组设计的两样本均数比较的t检验。

2 结果

2.1 各剂量铝饲料组大鼠海马ChAT、AchE的活性及Ach的水平 见表1，与对照组比较，中、高剂量铝饲料组大鼠海马中AchE的活性明显增高(P＜0.01)，ChAT活性明显降低(P＜0.01)，Ach含量显著减少(P＜0.01)。低剂量铝饲料组与对照组比较，均无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 各中药组大鼠海马ChAT、AchE的活性及Ach的水平

见表1，与高剂量铝饲料组比较，中、高剂量中药组大鼠海马中AchE活性显著降低(P＜0.01)，ChAT活性显著升高(P＜0.01)，Ach含量明显增加(P＜0.01)。低剂量中药组与高剂量铝饲料组比较，均无统计学意义(P＞0.05)，但有改善趋势。

表1 各组大鼠海马ChAT、AchE的活性及Ach的水平(±s，n=12)

表1 各组大鼠海马ChAT、AchE的活性及Ach的水平(±s，n=12)

与对照组比较:1)P＜0.01;与高剂量铝饲料组比较:2)P＜0.01

组别 AchE(U/mg) ChAT(U/mg) Ach(μg/ml)对照组1.41±0.18 312.15±36.21 22.35±7.23低剂量铝饲料组 1.51±0.06 285.34±38.25 17.62±2.87中剂量铝饲料组 1.81±0.131) 240.54±15.321) 13.92±5.211)高剂量铝饲料组 1.88±0.161) 221.13±17.461) 12.86±4.351)低剂量中药组 1.79±0.21 229.01±11.25 13.94±3.89中剂量中药组 1.48±0.152) 276.57±16.312) 18.16±1.252)高剂量中药组 1.42±0.272) 280.21±18.632) 21.31±1.682)

3 讨论

AD病因及发病机制主要有微量元素学说、胆碱能递质途径异常学说、淀粉样蛋白神经毒性学说、细胞凋亡学说、基因突变学说、钙代谢紊乱学说、自由基损伤学说、雌激素缺乏学说等。研究表明，铝与AD关系密切，过量接触与体内蓄积可能是AD的病因之一〔2〕。

现代医学认为，调节学习记忆功能的机制是多方面的，其中中枢胆碱能系统是构成学习记忆的主要通路，与学习记忆关系密切，其核心是Ach，是促进学习记忆的重要神经递质，对中枢神经系统有兴奋和抑制双重作用，以兴奋为主，参与大脑皮层的唤醒、情绪和运动的协调等功能的调节，特别是对学习和认知等方面被认为是关键环节之一〔3〕。Ach广泛分布在脑内，由胆碱、乙酰辅酶A在ChAT的催化下合成，并由AchE分解，ChAT和AchE共同作用维持Ach含量的动态平衡，二者的活性反映了Ach在脑中的合成和代谢速率。AD患者脑内ChAT活性下降被认为是AD的一个标志性生化特征。Lopez等〔4，5〕多个研究报道显示，老年性痴呆患者Ach合成减少，ChAT的活性下降，且与痴呆的严重程密切相关。AchE作为胆碱能纤维的标志，其活性增高，Ach分解加速，影响学习记忆和认知能力〔6，7〕。本结果显示，铝的过多摄入使大鼠海马Ach减少可能是AD发病的机制之一。

AD多属于脾肾亏损、脾虚痰阻，常表现为面色晄白，气短乏力，可兼有头晕眼花、腰膝酸痛、心悸等症，表明体内气血不足，阴虚阳弱。淫羊藿，性辛、甘、温，温肾阳，有补肾强阳、调节免疫和分泌系统、改善机体代谢和各器官功能;黄芪味甘，气微温，具有补肺益气固表，补气补血，能补五脏诸虚;熟地，味甘，微温质润，既补血滋阴，又能补精益髓，通血脉，益气力。水蛭，活血逐瘀，通经，具有减轻脑组织炎症反应，改善局部血流循环，保护脑组织免遭坏死及促进神经功能的恢复等功效。根据扶正固本、通经补肾、益气养血的治则，由上述组分为主配方组成通经补肾复方防治铝诱导的AD大鼠，本结果表明该复方能明显提高大鼠海马中ChAT活性，抑制AchE活性，增加Ach的合成，显著改善AD大鼠胆碱能系统功能，证明复方对海马组织有一定的保护作用，为临床治疗AD提供了理论依据。

1 Tomimoto H，Ohtani R，Shibata M，et al.Loss of cholinergic pathways in vascular dementia of the Binswanger type〔J〕.Dement Geriatr Cogn Disord，2005;19(5－6):282－8.

2 Gonda Z，Lehotzdy K，Midlsi A.Neurotoxicity induced by prenatal aluminum exposure in rats〔J〕.Neurotoxicology，1996;17(2):459.

3 索国玲，洪 丽，王秀利.丹参对幼年大鼠癫痫持续状态学习记忆及海马ChAT、AChE活性的影响〔J〕.东南大学学报(医学版)，2007;26(4):271－4.

4 Lopez OL，Hamilton RL，Becker JT，et al.Severity of cognitive payments and the clinical diagnosis of AD with Lewy〔J〕.Bodies Neurology，2000;54(9):1780－7.

5 Zhong CB，Xu XH，Wang XL.Advance in research on cholinergic theory of Alzheimer′s disease〔J〕.Chin Pharmacol Bull，2003;19(7):727－31.

6 Bartolucci C，Siotto M，Ghidini E，et al.Structural determinants of Tor－pedo Californian acetyl cholinesterase inhibition by the novel and orally active carbonate based anti－Alzheimer drug ganstigmine(CHF－2819)〔J〕.J Med Chem，2006;49(17):5051－8.

7 Gil－Bea FJ，García－Alloza M，Domínguez J，et al.Evaluation of cholinergic markers in Alzheimer′s disease and in a model of cholinergic deficit〔J〕.Neurosci Lett，2005;375(1):37.