RECK、MMP-14在喉癌组织中的表达及临床意义

左文娜，胡俊兰，冯立春，刘卫卫，李 健，代保强

(1沧州市中心医院，河北沧州 061001;2河北医科大学第四附属医院)

近来研究发现，基质金属蛋白酶(MMPs)是一类能降解细胞外基质及血管基膜的重要蛋白酶类，具有促进肿瘤侵袭及血管形成的作用。RECK(reversion-inducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs)基因可通过抑制多种MMPs的表达，抑制肿瘤的侵袭及转移。2008年12月～2010年1月，我们采用流式细胞术检测了41例喉癌患者癌组织中RECK和MMP-14的表达，探讨其在喉癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 取41例喉癌组织(喉癌组)、28例癌旁组织(癌旁组，距肿瘤切缘大于0.5 cm)及15例非喉癌患者(对照组)的喉部正常黏膜组织。所有肿瘤组织均经病理学确诊为鳞状细胞癌，癌旁组织及喉部正常黏膜组织均经病理证实为炎症或正常黏膜。全部病例术前均未行放疗、化疗，临床资料完整。喉癌组男36例，女5例;年龄42～76岁，中位年龄62岁;吸烟量 ＞400(年 ×支/日)者20例，≤400(年×支/日)者21例;癌肿直径≤3 cm者24例，＞3 cm者17例;有淋巴结转移13例，无淋巴结转移28例;病理学分级:G1组15例，G2组20例，G3组6例;喉癌分型:声门上型21例，声门型15例，声门下型5例;临床分期采用国际抗癌协会(UICC)2001年公布的TNM分类分期标准，Ⅰ、Ⅱ期16例，Ⅲ、Ⅳ期25例。

1.2 检测方法

1.2.1 单细胞悬液制备 取组织0.5 g左右，剔除坏死组织、纤维、脂肪及结缔组织。将组织放在120目不锈钢网上，下置一平皿，将组织剪碎，用眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，自然沉淀，收集细胞悬液。将混悬液用300目尼龙网过滤，去除细胞团块，收集细胞悬液。1 000 r/min离心2 min，弃上清液;再次1 000 r/min离心2 min，弃上清液。加入1 mL PBS将细胞悬浮，记数并调整细胞浓度为1×106/mL。

1.2.2 细胞的免疫荧光标记 取0.1 mL单细胞悬液，分别加入RECK、MMP-14兔抗人多克隆抗体工作液各 0.1 mL，浓度为:1∶100，37 ℃水浴 30 min。加入PBS缓冲液10 mL混匀，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液。加入羊抗兔FITC-IgG二抗工作液0.1 mL，避光室温孵育30 min进行荧光染色。加入PBS缓冲液10 mL混匀，1 000 r/min离心5 min，弃去上清液。去除未结合的荧光二抗。加入1 mL PBS液混匀，经500目铜网过滤后上机检测。

1.2.3 RECK和 MMP-14蛋白检测 采用美国Beckerman Coulter公司生产的EPics-XLⅡ型流式细胞仪，激发光源为15 mW氩离子激光器，激发波长为488 nm，应用ExPo32ADC进行免疫荧光数据分析，用Muticycle AN分析软件对DNA细胞周期拟合分析。检测前以 flow-checkTMFlourPheres(10 μm)荧光微球(REF 6605359.Beckman Coulter，Inc.Fullerton，CA92835)作为标准样品调整仪器CV值在2%以下。结果判定:RECK和MMP-14蛋白表达的定量分析，按照Morkve等提出的荧光指数(FI)表示RECK和MMP-14蛋白表达的相对含量。公式如下:FI=实验样品的均道值/正常组织样品的均道值，均道值=LogX-Mode×340。

1.3 统计学方法 所有数据结果经Excel整理，应用SPSS13.0统计软件进行t检验，单因素方差分析、SNK检验、直线相关及直线回归分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组RECK和MMP-14表达 见表1。

表1 各组RECK蛋白、MMP-14蛋白FI表达量比较(±s)

表1 各组RECK蛋白、MMP-14蛋白FI表达量比较(±s)

注:与癌旁组、对照组比较，*P ＜0.05

组别 例数 RECK蛋白 MMP-14蛋白喉癌组 41 0.759 3 ±0.105 8* 1.605 6 ±0.172 9*癌旁组 28 0.933 7 ±0.161 4 1.336 1 ±0.155 7对照组15 0.999 9 ±0.103 2 0.999 9 ±0.800 3

2.2 RECK蛋白和MMP-14蛋白的表达与喉癌临床病理参数的关系 见表2。喉癌组织中RECK蛋白和MMP-14蛋白之间呈负相关(r=－0.629，P＜0.01)。

表2 RECK及MMP-14表达与喉癌临床病理参数的关系

3 讨论

RECK是1998年日本学者Takahashi等发现的一种新的肿瘤抑制基因，具有独特的抑制基质金属蛋白酶表达与活性的功能，可抑制肿瘤浸润转移及血管生成。许多研究表明，RECK基因在肺癌、结肠直肠癌、胰腺癌等组织中低表达，其作为一个独立因素与患者预后密切相关，高表达的RECK肿瘤组织具有较小的侵袭性，且患者有更高的生存率［1，2］。Song等［3］报道，52%的胃癌组织RECK表达缺失，且与肿瘤分期、淋巴结转移呈负相关。李晟磊等［4］报道，食管癌RECK的表达明显低于正常食管组织，且与肿瘤的分化程度、浸润深度及淋巴结转移密切相关。本研究结果显示RECK在喉癌组织中的表达低于癌旁组织及正常黏膜组织，提示RECK在喉癌组织中的低表达可能与喉癌的发生有关。本研究还发现RECK的表达与喉癌临床分型无关，而与病理分化程度、临床分期及有无淋巴结转移有关。喉癌的病理分化程度越低，临床分期越晚，且有淋巴结转移的情况下RECK蛋白表达明显下调，提示RECK作为一种肿瘤转移抑制基因参与了抑制喉癌的浸润和转移。RECK基因可作为喉癌诊断治疗及预后评估的重要病理学指标。

MMPs家族是降解细胞外基质(ECM)的主要酶类，在肿瘤侵袭和转移中具有重要意义。MMP-14是MMPs家族中的一种特殊蛋白酶，研究表明，MMP-14分解区蛋白可被以可溶形式分泌于细胞外。MMP-14能直接降解、破坏肿瘤患者的细胞外基质和基底膜，破坏阻挡肿瘤细胞浸润的屏障，并通过对MMP-2酶原的激活进一步加强这种作用。本研究结果显示，MMP-14在喉癌组织中高表达，其表达量与临床分期、淋巴结转移、病理分化程度有关，喉癌的病理分化程度越低，临床分期越晚，且有淋巴结转移的情况下MMP-14蛋白表达明显升高。以上结果与刘冬玲等［5］及姚广裕等［6］研究报道基本一致。由此推测MMP-14可促进肿瘤的生长，侵袭和转移。

RECK和MMP-14在LCC的表达及相关性研究发现RECK通过抑制MMP-14的加工中必需的水解酶，调控MMP-2的活化。RECK能通过调节MMP-2、MMP-9、MMP-14的活性而抑制肿瘤的入侵和转移。本研究观察到RECK蛋白和MMP-14蛋白之间有显著的线性相关关系，为负相关。说明RECK有可能通过下调MMP-14的表达而抑制喉癌的侵袭作用，但具体机制有待进一步阐明。

综上所述，RECK和MMP-14与喉癌的发生、发展有关，有可能成为判断肿瘤侵袭性及预后的一项参考指标。

［1］Takemoto N，Tada M，Hida Y，et al.Low expression of reversioninducing-cysteine-rich protein with Kazal motifs(RECK)indicates a shorter survival after resection in patients with adenocarcinoma of the lung［J］.Lung Cancer，2007，58(3):376-383.

［2］Clark JC，Thomas DM，Choong PF，et al.RECK-a newly discovered inhibitor of metastasis with prognostic significance in multiple forms of cancer［J］.Cancer Metastasis Rev，2007，26(3，4):675-683.

［3］Song SY，So HJ，Nam E，et al.Expression of reversion-inducingcysteine-rich protein with Kazal motifs(RECK)as a prognostic indicator in gastric cancer［J］.Eur J Cancer，2006，42(1):101-108.

［4］李晟磊，赵秋民，刘宗文，等.食管鳞癌中RECK和MMP-9蛋白表达相关性及临床病理意义［J］.世界华人消化杂志，2007，15(10):1082-1086.

［5］刘冬玲，李娜萍.MMP-14、VEGF、E-cadherin与子宫颈癌生物学行为的相关性研究［J］.华中科技大学学报(医学版)，2006，35(6):774-777.

［6］姚广裕，林鹏，于军业，等.MMP-14在乳腺癌中的表达及临床意义［J］.肿瘤防治研究，2005，32(5):268-270.