大肠埃希氏菌在葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎恢复中的作用*

李旺林，曹 杰，肖焕擎，张伟健，杨 平，钟俊斌，张 通

(广州医学院附属广州市第一人民医院胃肠外科，广东 广州 510180)

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一类肠道慢性、反复发作性非特异性炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)和克罗恩病(Crohn's disease，CD)。IBD在我国的发病率逐年升高。肠道菌群是结肠炎症发病的必要条件［1］，但关于肠道正常菌群在结肠炎症恢复中的作用并未得到充分重视，目前国内外尚未见相关报道。本课题拟对此进行探索，以明确肠道大肠埃希氏菌(Escherichia coli，E.coli)在结肠炎症恢复中的作用。

材料和方法

1 试剂

葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)分子量5 kD，购自Sigma，用生理盐水配制成3.5%浓度［2］。抗生素混合物:卡那霉素(8 g/L)、庆大霉素(0.7 g/L)、多黏菌素(3.4 ×107U/L)、甲硝唑(4.3 g/L)和万古霉素(0.9 g/L)加入饮用水中。

2 动物

2.1 细菌耗竭小鼠(bacteria－depleted mice，BD小鼠)的制作 6周大成年小鼠，通过添加混合抗生素(每天每只鼠用100 μL混合抗生素)来耗尽肠腔内细菌，加入饮用水2周，制作BD小鼠。使用抗生素后，收集小鼠新鲜粪便样本，每天在3种不同培养基、有氧和无氧条件下进行细菌检测。培养基中不能检测出细菌为BD小鼠制作成功。

2.2 动物及分组 BALB/c小鼠，SPF级，雌性，8周龄，体重(19.2 ±2.0)g，分笼饲养，平均每笼6 只。温度20～22 ℃，相对湿度55%±5%。建立12 h明暗周期。随机分成4组:(1)生理盐水组，不用DSS水喂养，一直饮用正常饮用水;(2)单纯DSS组，正常BALB/c小鼠DSS 5 d造模+正常饮用水14 d;(3)BD小鼠+DSS组(无E.coli处理组)，BD小鼠5 d造模+正常饮用水14 d;(4)BD小鼠+DSS+E.coli组(E.coli处理组)，BD小鼠DSS 5 d造模+正常饮用水(同时以E.coli喂养，每次1×109CFU，每2 d喂养1次)14 d。

2.3 动物处理 前5 d自由饮用3.5%DSS溶液造成溃疡性结肠炎模型［2］，然后继续正常饮水14 d。前3组均予以正常饮食饮水;BD小鼠E.coli处理组予以E.coli喂养，1×109CFU/次，每2 d喂养1次。每天测量动物体重，记录大便性状和隐血情况，计算疾病活动度(disease activity index，DAI)评分，具体评分标准见表1。同时记录小鼠的死亡情况。第14 d，二氧化碳法处死小鼠，游离结肠和远端回肠，取出肛门至盲肠末端的整个结肠和直肠段，观察各组小鼠结肠的大体改变，测量整个结肠长度。用预冷无菌生理盐水将结肠冲洗干净，分别于结肠末端(距肛门1 cm)处剪取0.5 cm长的结肠，4%甲醛浸泡，石蜡包埋、切片，HE染色做病理检查。

表1 DAI评分标准Table 1.DAI scoring standard

3 按前述解剖方法获取的组织学标本HE染色

标本固定、石蜡包埋、切片及HE染色后，由病理科医生采用盲法对病理切片进行评分。结肠炎的组织学严重程度依照Cooper等［3］提出的评分标准分为黏膜损害(D)和病变范围(E)两方面。具体评分标准:黏膜损害(D):0分:无;1分:靠近基膜1/3的隐窝丢失;2分:靠近基膜2/3的隐窝丢失;3分:隐窝全部消失，上皮细胞完整覆盖;4分:隐窝、上皮均消失;病变范围(E):0分:无;1分:局灶性;2分:病变约累及1/3黏膜;3分:病变约累及2/3黏膜;4分:病变累及全部黏膜组织。组织病理学评分的总分(histological score，HS)等于D与E的乘积，即HS=D×E。

4 结肠组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的检测

依Krawisz等［4］方法测定组织MPO活性，作为评价中性粒细胞浸润的指标之一。取50～100 mg病变结肠组织，准确称量后迅速至液氮中冷却，－80℃保存。测定时将组织切碎制成匀浆，离心后取上清液于460 nm处测吸光度(A)值，5 min后再次测定，获得该样本的MPO活性，以U/g组织表示。

5 免疫组织化学方法检测核转录因子－κB(nuclear factor kappa B，NF －κB)活化

应用标准的三步法(标记的链酶亲和素－生物素法，即LSAB法)进行检测。Ⅰ抗为NF－κB p65亚基［5］的特异性单克隆抗体:Ⅱ抗为生物素标记山羊抗鼠IgG抗体，两者均为Santa Cruz产品。取400倍视野5个进行评分，取其平均。根据NF－κB阳性细胞百分比进行评分，评分标准参照文献［6］:0分:0% ～1%;1分:2% ～5%;2分:6% ～10%;3分:11% ～25%。

6 统计学处理

采用GraphPad Prism软件进行数据处理，数据用均数±标准差()表示。组织学评分采用非参数检验，其余数据使用单因素方差分析，以P＜0.05为有统计学意义。

结 果

1 体重变化

各组饮用DSS的小鼠体重均有下降，而且在停止饮用DSS后正常BALB/c小鼠体重继续稍有降低，无E.coli处理的BD小鼠组体重继续出现下降，E.coli处理组体重亦稍有下降。至实验第18 d，后两组体重比较有显著差异(P＜0.05)，见图1。

Figure 1.Weight changes of the mice in different groups..n=10，*P ＜0.05 vs BD+DSS+E.coli group.图1 各组体重变化

Figure 2.The change of survival rate in each group after DSS treatment.n=10.图2 DSS处理后各组生存率的变化

2 各组的死亡率

观察至实验结束，生理盐水组、DSS组和E.coli处理组的存活率均为100%;无E.coli处理组的死亡率为40%。这说明，BD小鼠经DSS处理增加了死亡率。而对DSS处理的BD小鼠随后的E.coli喂养减少了其死亡率，见图2。

3 小鼠的DAI评分

饮用DSS的小鼠从第3 d开始出现大便隐血阳性，DAI评分均见不同程度的增加，停止饮用DSS后DAI评分继续缓慢增高，各组在实验第10 d DAI评分出现一次高峰，而后DSS组和E.coli处理组评分缓慢下降;至实验结束时DSS组DAI评分低至5.3±1.7;E.coli处理组 DAI评分与无 E.coli处理组有显著差别(P＜0.05)，见表2。

表2 各组小鼠DAI评分Table 2.DAI scores of the mice in different groups(.n=6)

表2 各组小鼠DAI评分Table 2.DAI scores of the mice in different groups(.n=6)

△P ＜0.05 vs DSS;*P ＜0.05 vs BD+DSS.

Group 3 d 6 d 10 d 18 d Normal saline 0 0 0 0 DSS 2.6±1.0 7.6±2.1 7.0±1.8 5.3±1.7 BD+DSS 2.2±0.7 7.4±1.6 8.7±0.4△ 9.8±0.4△BD+DSS+E.coli 2.3±0.4 7.5±0.5 7.0±0.6* 6.4±0.3*

4 小鼠结肠重量与长度变化

饮用DSS的小鼠结肠长度较正常小鼠缩短，其中单纯DSS组小鼠和E.coli处理组结肠长度稍长于无E.coli处理的BD小鼠组(P＜0.05);将结肠清洗后测量全结肠重量，与无E.coli处理组比较，E.coli处理组重量减轻，两者差异显著(P＜0.05)，见表3。

表3 不同处理组的结肠长度、结肠重量、组织病理评分、MPO活性和NF－κB评分Table 3.Colon length，colon weight，histological score(HS)，MPO activity and NF－κB score in different groups(.n=8)

表3 不同处理组的结肠长度、结肠重量、组织病理评分、MPO活性和NF－κB评分Table 3.Colon length，colon weight，histological score(HS)，MPO activity and NF－κB score in different groups(.n=8)

△P ＜0.05 vs DSS;*P ＜0.05 vs BD+DSS.

Group Colon length(cm)Colon weight(mg) HS MPO(U/g) NF－κB Normal saline 8.8 ±0.6 323.3 ±23.2 0.0 ±0.0 0.2±0.1 0.3 ±0.5 DSS 6.9 ±0.9 450.3 ±25.6 6.3 ±2.4 0.9 ±0.2 2.3 ±0.5 BD+DSS 6.2 ±0.6△ 638.7 ±20.6△ 9.2 ±2.3△ 0.4 ±0.2△ 1.0 ±0.0△BD+DSS+E.coli 6.8 ±0.9* 474.7 ±19.1* 6.8 ±2.1* 0.9 ±0.1* 2.3 ±0.6*

5 小鼠结肠病理组织学

无E.coli处理的BD小鼠在恢复期结肠组织学见炎症累及黏膜基底层，表现为广泛的黏膜、腺体缺损，隐窝破坏和大量的炎症细胞浸润。E.coli处理后，小鼠结肠黏膜缺损部分修复，隐窝破坏减少，炎性细胞浸润减轻，炎症深度约为粘膜全层1/3～2/3;单纯DSS组组织损伤稍轻。与无E.coli处理组比较，E.coli处理组组织损伤减轻，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图 3、表 3。

6 MPO活性

E.coli组肠黏膜MPO活性与无E.coli处理组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

7 活化的NF－κB免疫组织化学染色及半定量分析

DSS组和E.coli处理组可见较多NF－κB活化的细胞，即阳性细胞。活化的NF－κB主要见于固有层中，高倍镜下可见染色主要位于细胞核，呈棕褐色。相比之下，无E.coli处理组阳性细胞明显减少。无E.coli处理组活化的NF－κB评分明显低于DSS组和E.coli处理组，见图4、表3。

讨 论

IBD被认为起因于肠道菌群的免疫反应失调，但肠道菌群影响IBD的发展机制目前仍不清楚［7］。肠腔内每克粪便中包含多达1×1011个细菌。肠道微生物与之间的相互沟通和黏膜已被证明可以调节肠道基因的表达。细菌菌落已被证明在IBD发展中起着重要作用。在这种疾病的各种小鼠模型中，在无菌条件下不能产生肠道炎症，而在无菌性小鼠中重新植入小鼠的正常肠道菌群，则可以导致肠道炎症的发生［8］。肠黏膜中非致病性微生物可以改变免疫反应在体外肠上皮屏障功能。E.coli是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的一种细菌［9］，周身鞭毛，能运动，无芽孢，主要生活在大肠内，为大肠内的正常菌群。肠道正常E.coli是否参与了实验性结肠炎的恢复，目前尚未见相关报道。

Figure 3.HE staining of the mouse colon sections(×40).A:normal saline;B:DSS;C:BD+DSS;D:BD+DSS+E.coli.图3 小鼠结肠HE染色

Figure 4.NF － κB detection of the mouse colon sections(×200).A:normal saline;B:DSS;C:BD+DSS;D:BD+DSS+E.coli.图4 小鼠结肠NF－κB检测

通常来说，DSS诱导所造成的小鼠结肠炎能够自愈［10］。相反，BD小鼠口服抗生素2周，不能够从DSS诱导引起的损伤中恢复，表明宿主肠道微生物的相互作用是恢复的必需的条件。实验结果证明，共生的 E.coli能够降低BD小鼠中DSS诱导小鼠的死亡率，促进结肠炎症恢复。外源性E.coli的喂养能够促进结肠炎症恢复，降低DSS诱导炎症小鼠死亡率，强烈提示了肠道E.coli在DSS诱导结肠炎症中的恢复作用，提示正常肠道E.coli的存在是结肠炎症恢复的必要条件，正常肠道E.coli可能能够治疗结肠炎症，在结肠炎症中调整肠道菌群有助于肠道炎症恢复。

由于肠黏膜炎症坏死溃疡形成导致结肠缩短，这些改变客观地反映了肠组织的损伤程度。饮用DSS小鼠结肠长度均较正常小鼠缩短，但喂养结肠正常肠道E.coli可以阻止结肠缩短，这可能与E.coli能够减少肠道炎症，减少疤痕形成有关。病理组织学方面，各组小鼠结肠大体较呈现肠腔内少量积血，镜下见隐窝和腺体有不同程度的破坏，但炎性细胞浸润较为明显。E.coli治疗组可以恢复肠黏膜完整性，减少肠道出血和炎症细胞的浸润，动物组织学评分比较常规组均有降低。结果说明E.coli对DSS诱导的结肠炎症有促进恢复的作用。

给BD小鼠喂养大肠阴性杆菌能够提高DSS所致NF－κB的活化指标，与无E.coli喂养组比较，差异有统计学意义。因此，上述研究结果提示，正常大肠阴性杆菌可以促进NF－κB活化，促进炎性细胞趋化，加速炎症恢复。肠道中无正常菌群的小鼠NF－κB的活化指标较低，而且不能从DSS诱导的结肠炎症中自行恢复。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)来源于肠道菌群，是革兰阴性细菌细胞壁的主要成分之一，可通过破坏的上皮屏障进入循环并激活NF－κB［11］，如前所述，NF－κB是调控一系列炎症因子表达的转录因子。由于肠道中无正常菌群，所以肠道中缺少LPS，而LPS缺乏导致了肠道内NF－κB不能或者较少激活，从而不能启动肠道的抗炎保护机制，使之难以从DSS诱导肠炎中自行恢复。在我们给小鼠喂养E.coli后，增加了肠道内LPS含量，从而使NF－κB能够正常激活，这一条抗炎途径能够启动，使小鼠能够在DSS诱导的结肠炎中逐渐得到恢复。提醒我们，肠道正常菌群的存在可能是肠炎恢复的必要条件。

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