传统药物黄花列当提取物清除DPPH的活性研究△

2012-07-30 13:01许国青王晓琴崔佳颖李万强
中国民族医药杂志 2012年9期
关键词:正丁醇黄花光度

许国青 王晓琴 崔佳颖 李万强

(1.内蒙古自治区卫生干部教育培训中心,内蒙古 呼和浩特 010031;2.内蒙古医学院药学院,内蒙古 呼和浩特 010110)

黄花列当(Orobanche pycnostachya Hance)为列当科(Orobanche)列当属植物,为多年生、二年生或一年生寄生草本,主要寄生于蒿属植物的根上[1]。全草入药,具有补肾助阳、强筋骨的功能,用于治疗腰膝冷痛、阳痿、遗精,蒙医药还用于治疗碳疽,民间常做肉苁蓉的代用品[2]。

本文首次研究了黄花列当70%乙醇粗提物和不同萃取部位对[DPPH·]自由基的清除作用。自由基包括活性氧类,存在于体内外,是生物体正常代谢中形成的,影响着各种生理活性。生物体内过量的氧自由基会导致一系列疾病,如血管粥样硬化、高血压、糖尿病、癌症、帕金森病及老年痴呆症等。所以能消除活性氧的抗氧化剂受到了人们更多的关注。一些蒙医药药治病的机理也被认为与其抗氧化活性有密切关系。

DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)通常被用来检测抗氧化剂的抗氧化活性[3-6]。[DPPH·]是一种稳定的有机自由基,它的稳定性主要来自共振稳定作用及3个苯环的空间障碍,而使夹在其中氮原子上的不成对电子不能发挥其应有的电子成对作用。[DPPH·]在517nm波长处有强吸收峰,溶液呈紫色,其浓度与吸光度呈线性关系。当在溶液中有自由基清除剂存在时,清除剂提供的质子会和[DPPH·]结合形成[DPPH·-H]或发生替代,使[DPPH·]自由基数量减少,从而使溶液颜色由紫色变为黄色,表现为在517nm处的吸光度不断减小。借此可以用来表征某种物质对自由基的清除能力。一般用IC50值来评价此物质抗氧化活性的大小。IC50值越小,表示该物质清除[DPPH·]性越强。本实验研究了黄花列当对[DPPH·]自由基的清除作用,为其进一步深入研究利用提供了一定的理论基础。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂:黄花列当药材于2010年3月购自内蒙古自治区中蒙医院蒙药房;自由基DPPH(Sigma Aldrich公司生产);抗坏血酸(天津市科盟化工工贸有限公司);所用溶剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备:OSB-2100型旋转蒸发仪(东京理化);KQ3200DE型数控超声波清洗器〔昆山市超声仪器有限公司);TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);DGG-9070B型电热恒温鼓风干燥箱;电子天平(YP5001N);分析天平(梅特勒 -托利多AL204);冻干机(基因有限公司)。

2 实验方法

2.1 提取部位制备:干燥的黄花列当4 kg粉碎,70%乙醇回流提取2次,合并药液,回收乙醇,得到70%乙醇总提物(hh4),浸膏加入适量水混悬,依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取,回收溶剂,挥干,得乙酸乙酯部位(hh1)浸膏146.9g、正丁醇部位(hh2)浸膏185.5g和水(hh3)部位420.8g。4部位样品均取部分冷冻干燥,备用。

2.2 溶液配制

2.2.1 [DPPH·]溶液的配制:精确称取 DPPH 粉末2.0 mg,用乙醇溶解,定容,配成 0.01mg·mL-1的 DPPH 无水乙醇溶液,置于冰箱内在4℃下避光保存,待用。

2.2.2 对照品 Vc的配制:精确称取 Vc粉末2.5mg,用乙醇溶解后转移至50ml容量瓶内,定容,摇匀得质量浓度为0.05 mg·mL-1的 Vc 对照品溶液;依次稀释为 0.01 mg·mL-1、0.02 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.04 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1的溶液;置于冰箱内在4℃下避光保存,待用。

2.2.3 样品溶液的配制:精密称取约 2.5mg的 hh1、hh2、hh3和 hh4冻干粉末,分别用乙醇溶解后,配成0.05mg·μmL-1的溶液;依次稀释为 0.01mg·μmL-1、0.02mg·μmL-1、0.03mg· μmL-1、0.04mg· μmL-1、0.05mg·μmL-1的溶液;置于冰箱内在4℃下保存,待用。

2.3 清除[DPPH·]自由基能力的测定

2.3.1 对照品Vc的测定:吸取无水乙醇0.1mL与4.9mL的[DPPH·]溶液(0.01mgμmL-1)在试管中混合,摇匀后迅速倒入石英吸收池中,以无水乙醇作空白,立即用紫外可见分光光度计在517nm处测定吸光度,此时的数据为Aj。

依次吸取质量浓度为 0.01 mg·mL-1、0.02mg·μmL-1、0.03mg·μmL-1、0.04mg·μmL-1和 0.05mg·μmL-1的Vc 对照品溶液0.1ml分别与4.9ml[DPPH·]溶液(0.01mg·μmL-1)在试管中混合,摇匀后迅速倒入石英吸收池中。以0.1mLVc对照品溶液和4.9mL无水乙醇的混和后作空白,立刻用紫外可见分光光度计在517nm处测定吸光度,第 0、1、2、3、4、5min 分别测一次吸光度(若每分钟吸光度值改变不超过0.003个单位则停止测量),之后每隔5min测一次吸光度,直到30min时结束,此时的数据为Ai。

2.3.2 样品的测定:分别依次吸取质量浓度为0.01mg·μmL-1、0.02mg· μmL-1、0.03mg· μmL-1、0.04mg·μmL-1和 0.05mg·μmL-1的 hh1、hh2、hh3、hh4 样品溶液按上述方法与DPPH反应,并测定Ai。

2.3.3 计算清除率:按公式计算对照品和各样品对[DPPH·]自由基的清除率(I)。

I=[1-(Ai/Aj)] ×100%

3 结果与讨论

以清除率(%)为纵坐标,样品溶液的质量浓度(mgμmL-1)为横坐标,绘制标准曲线,根据标准曲线计算IC50(mgμmL-1)值。结果见图1和表1。

图1 弯管列当各提取部位对DPPH·的清除能力

表1 黄花列当各提取部位对DPPH·的清除作用

由图1、表1可知,黄花列当4个组分对DPPH·的清除能力随各组分浓度的增大而增强。从回归方程得各组分的IC50值(mgμmL-1)从小到大依次为:对照品 Vc(0.0718)<乙酸乙酯部位(0.0997)<正丁醇部位(0.1284)<70%乙醇总提物(0.1732)<水部位(0.4538)。

以维生素C作为对照品,结合[DPPH·]法评价黄花列当提取物的抗氧化活性。实验结果表明黄花列当各萃取组分都具有不同程度的抗氧化活性,其中乙酸乙酯部位的清除[DPPH·]自由基活性最强,正丁醇部位也有较好的清除[DPPH·]自由基活性,水部位的清除[DPPH·]自由基能力较弱。这个结果初步证实传统药物黄花列当具有很强的抗氧化活性,应用前景十分广阔,为蒙医临床提供了有力证据。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京:科学出版社,1990,69:113-114.

[2]内蒙古植物药志编辑委员会.内蒙古植物药志,第五卷[M].呼和浩特:内蒙古人民出版社,1980:311.

[3]曲欢欢,李白雪,燕菲,等.用清除有机自由基DPPH法评价连翘不同部位抗氧化作用[J].中国中医药信息杂志,2008,15(增):32-34.

[4]王晶,李丽,刘春明,等.不同红药提取物中总酚的测定及抗氧化活性的DPPH法评价研究[J].辽宁中医杂志,2011,38(3):513-515.

[5]关立立,侯微,金银萍,等.干玉竹根与鲜玉竹根萃取组分清除DPPH·活性比较[J].特产研究,2011,(1):42-58.

[6]袁亚男,陈承瑜,杨滨,等.31种黄酮、酚酸类化合物和10种中药清除 DPPH能力考察[J].中国中药杂志,2009,34(13):1695-1700.

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