牛病毒性腹泻-黏膜病的流行病学调查

邓明亮 费文涛 纪素坤 张 瑞 陈颖钰 郭爱珍 *

1.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；2.华中农业大学动物科技学院，武汉 430070；3.华中农业大学农业微生物学国家重点实验室，武汉 430070

牛病毒性腹泻（BVD）又称牛病毒性腹泻-黏膜病，是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的一种病理过程复杂、临床表现多样的传染病。病牛临床表现为腹泻，急、慢性黏膜病，持续性感染与免疫耐受，母畜流产、产死胎和畸形胎等[1]。本病世界广泛流行，1980年李佑民首次从流产胎儿脾脏中分离到BVDV，证实了我国也存在本病。其后在全国20多个省、市都相继发现了该病的存在[2-4]。该病较少表现特征性临床症状，且多伴有持续感染和免疫耐受等隐性感染，加之缺乏安全有效的BVD疫苗，给该病的防控带来了很多困难，导致我国牛群BVDV感染日趋严重[5]。BVDV除感染肉牛、奶牛、水牛和牦牛外，还可感染羊、猪、鹿等多种家养和野生动物[6-7]。杨得胜等[8]对福建省9个地区2006-2008年的15个大型牛场和56个散养户牛进行血清学调查，品种包括奶牛、肉牛和水牛，平均阳性率达93.1%。菅复春等[9]对河南省的6个奶牛场、5个肉牛养殖场的181份牛奶样品和395份血清样品进行BVD抗体的检测，牛奶样品平均阳性率为58.6%，肉牛血清样品平均阳性率为31.39%。高双娣等[10]利用细胞中和试验对陕西、甘肃、宁夏、青海和四川5省（区）部分地区的黄牛群和牦牛群进行BVDV调查，结果黄牛群BVD阳性检出率为46.15%，牦牛群BVD阳性检出率为30.08%。

BVD可严重影响牛的繁殖和生产，给养牛业造成严重的经济损失；而我国的规模化养牛场主要集中在北方地区，为了解北方地区牛群中该病感染情况，我们对采自北方地区2个大型屠宰场（屠宰的肉牛主要来源于东北各地养殖场）和青海地区的牦牛血清进行了本病的流行病学调查，以便为今后对该病的净化与防控工作提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

牛病毒性腹泻抗体检测试剂盒和牛病毒性腹泻抗原检测试剂盒，均购自IDEXX。收集内蒙古通辽市大型屠宰场肉牛血清276份，辽宁大连市大型屠宰场肉牛血清164份。屠宰场的肉牛均来自北方各地养殖场。牦牛血清：采自青海省祁连县、天骏县、湟源县、海晏县和门源县5个县共400份。

1.2 方法

1）牛病毒性腹泻抗原检测试剂盒操作方法：若于冰箱中保存，应使所有组件于18～30℃下平衡30min；将SNAPBVD检测器放置于平整的表面上，在整个检测过程中，均必须将SNAPBVD检测器保持在水平位置，以确保结果精准；将150μL样品加入干净的样品管内；将200μL结合物加入样品管内；将样品管盖上，并上下颠倒3～5次以充分混匀。将含有结合物混合液的加盖样品管放入45℃的培养箱中，至少培养10min；将样品管中的内容物注入样品孔中；15～60s后，样品会流过结果窗并达到启动环；在启动环中呈色时，稳固按下启动器，直到启动器与SNAP检测器的本体齐平为止，用力按下；10min后判读检测结果。

2）牛病毒性腹泻抗体检测试剂盒操作方法：所有试剂在使用前一律恢复至室温（18～25℃），轻轻摇动或旋转，使试剂混合均匀。用移液器在酶标板每孔中加入100μL样品稀释液，在相应的阴性和阳性对照孔中加入25μL对照血清，平行做2孔，其他各孔均加入25μL检测血样；轻弹酶标板或用振荡器振荡，将酶标板中的溶液充分混匀；在室温（18～25℃）孵育90min，然后将反应孔中的溶液吸出。在每个反应孔中加入约300μL洗涤液进行洗涤，洗涤5次；每次洗涤后吸出所有孔中的液体，在最后1次洗涤完成后，将酶标板在吸水纸上拍干；再在每个反应孔中加入100μL酶标抗体，室温下（18～25℃）孵育30min；再洗涤5次，在每个反应孔中加入100μLTMB底物，室温下避光孵育10min后，每个反应孔中加入100μL终止液终止反应；将酶标仪在空气中调零，用450nm波长测定和记录样品以及对照的吸光值。

3）检测判读。抗原检测判读：阳性结果（PI状态）——若样品点中所呈现的蓝色比背景深时，则该样品被判为阳性。阴性结果（Non-PI（非持续感染）状态）——若样品点中的蓝色与背景相同或比背景浅时，则该样品被判为阴性。

抗体检测判读：阳性对照的平均值（PCX）与阴性对照的平均值（NCX）之间，P-N的差必须大于或等于0.150的吸光（OD）值；另外，阴性对照平均值（NCX）必须小于或等于0.250的OD值，表明检测结果有效。计算待检血清的（样品OD值-阴性OD值）/（阳性OD值-阴性OD值）（S/P值），若S/P值＜0.200，则判为BVDV抗体阴性；S/P值＞0.300，则判为BVDV抗体阳性。

2 结果与分析

2.1 抗原检测结果

对采自内蒙古通辽市、辽宁大连市的2个大型屠宰场共440份肉牛血清和青海省5个县的400份牦牛血清进行了BVD血清学抗原检测，结果显示3个地区均检出抗原阳性血清，共检出抗原阳性血清6份，平均阳性率为0.71%，最高阳性率达1.96%，见表1。

BVD血清学抗原检测结果显示不同品种感染情况也不同，肉牛、牦牛血清抗原阳性数均为3份，但阳性率分别为0.68%、0.75%，见表2。

2.2 抗体检测结果

随机抽取668份血清（肉牛血清392份、牦牛血清276份）进行BVD血清学抗体检测，包括以上抗原检测为阳性的6份血清，结果显示共检出阳性血清392份，平均阳性率58.68%，最高阳性率达84.48%，最低阳性率20%，见表3；并且血清学抗原阳性的6份血清抗体检测均为阴性，表明肉牛、牦牛群均存在PI牛，PI牛检出率分别为 0.77%、1.09%，见表 4。

不同品种的血清学抗体阳性率也不同，肉牛、牦牛血清抗体阳性数分别为248、144份，阳性率分别为63.27%、52.17%，见表5。

表1 不同地区BVD血清学抗原检测结果

表2 不同品种BVD血清学抗原检测结果

表3 不同地区BVD血清学抗体检测结果

表4 PI牛检测结果

表5 不同品种BVD血清学抗体检测结果

3 讨 论

近年来，我国养牛业发展迅速，但随着养牛规模的不断扩大，BVD也呈迅猛传播之势，对养牛业造成了巨大损失，给整个畜牧业发展带来了严重影响。雪梅等[11]于2002-2006年对四川阿坝牧区的牦牛进行了调查和统计，阿坝、红原和若尔盖3个县部分地区共发病1983头，死亡362头，死亡率为18.26%；通过BVD琼脂扩散试验和BVD血清中和试验进行血清学检查，阳性率分别为25.0%和42.3%。薛艰省等[12]对青海省高寒牧区牦牛进行了感染情况调查，对来自玛沁县的87份血清样品进行检测，结果在87份血清样品中检出阳性10份，占11.49%；流行病学调查久治县存栏牛7715头，发病1750头，死亡225头，发病率和死亡率分别为22.68%和2.92%。邱昌庆等[13]对山东、河南和河北省的6个规模化肉牛场进行抗体、抗原检测，证实我国中原地区肉牛群中BVD感染严重。

本次对内蒙古、辽宁肉牛和青海牦牛群进行血清学调查，结果显示3个地区均检出抗原阳性血清，共检出抗原阳性血清6份，平均阳性率为0.71%，最高阳性率为1.96%。血清学抗体平均阳性率为58.68%，最高阳性率达84.48%，最低阳性率20.00%。表明BVD在我国北方牛群中普遍存在，而且感染率和感染范围日趋严重。分析其主要原因可能是集约化规模养殖的发展提高了牛只间传染的概率；近年来北方地区极端天气的多发引起机体抵抗力下降；该病特征性临床症状较少，在实际生产中易被忽视；牛群缺乏系统的监测防控措施等。

调查发现，检出的6份抗原阳性血清其对应血清抗体检测均为阴性，表明牛群中存在PI牛，肉牛、牦牛PI牛检出率分别为0.77%、1.09%，与国外报道的PI牛检出率（0.5%～2.0%）基本相符[14]。而肉牛、牦牛群抗体阳性率分别为63.27%、52.17%，这说明血清抗体阳性率与PI牛检出率二者之间没有线性关系，与张俊杰等[15]调查的结果一致。虽然PI牛的存活时间一般不超2a，但终生带毒并通过鼻液、唾液、尿液、眼泪和乳汁等分泌物向体外排毒，成为该病的危险传染源，在规模化养殖场中随着牛只的频繁转群变动1头PI牛就可以在其1a左右的生存期内使整个牛群感染BVDV。因此必须制定有效的BVD清除计划，加强PI牛的检测，全群筛查并淘汰PI牛，逐步达到净化牛群的目的。

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