野生石蒜中石蒜碱和加兰他敏的分离研究

熊海蓉，李 霞，文祝友，赵明明，熊远福，刘 英

(1.湖南农业大学分析测试中心，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学理学院，湖南 长沙 410128；3.湖南农业大学动物科技学院，湖南 长沙 410128)

石蒜属(Lycoris)植物的主要活性成分为生物碱类，其中石蒜碱和加兰他敏具有良好的药理作用。目前我国石蒜的开发和应用十分有限。石蒜碱(Lycorine)，是一种异喹啉类生物碱，为吡咯骈啡星啶的衍生物[1～3]。加兰他敏(Galanthamine或Galantamine)，是一种四环生物碱，在药理上是一种具有可逆作用的胆碱酯酶抑制剂[4,5]。

目前，对石蒜所含生物碱的临床药用研究很多[1，4，6]。据报道[7]，生物碱的分离大多数采用高速逆流色谱法(HSCCC)。高速逆流色谱法分离石蒜提取物中石蒜碱和加兰他敏，与溶剂萃取法相比，纯度更高，可以大量连续操作；与柱层析法相比，分离过程中无需添加其它辅助物质，且分离效果更佳。目前，国内尚未见到用高速逆流色谱法同时分离石蒜中石蒜碱和加兰他敏的报道。作者在此运用高速逆流色谱法同时分离野生石蒜提取物中石蒜碱和加兰他敏，探索分离石蒜碱和加兰他敏的条件，以期为野生石蒜主要药用成分的综合利用提供参考。

1 实验

1.1 材料、试剂和仪器

野生石蒜，湖南九嶷山；大孔树脂HPD(工业级)，沧州宝恩化工有限公司。

石蒜碱标样、加兰他敏标样(纯度≥94%)，株洲惠心生物化工有限公司；所用试剂均为分析纯。

TBE-300A型高速逆流色谱仪，上海同田生物技术有限公司；1200型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；RE-52AA型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；AL204型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 粗提物的纯化

准确称取约0.5 g野生石蒜粗提物[6]，用100 mL无水乙醇溶解，再加300 mL超纯水配成母液。向柱中加稀释后的乙醇(无水乙醇与水的体积比为1∶3)排气泡。将母液上柱，上样体积为9 BV，流速为2 BV·h-1，用处理过的大孔树脂吸附完全；再用5 BV超纯水洗涤，然后用10 BV 70%乙醇洗脱，流速为2 BV·h-1。收集解吸液，得到纯化后的石蒜碱和加兰他敏的乙醇溶液[2,6]，将溶液浓缩至小体积，再冷冻蒸发干燥，得到固态石蒜样品。

1.3 溶剂体系的选择

HSCCC法分离溶剂体系应满足以下条件：不造成样品的分解与变性；有足够高的样品溶解度；样品在系统中有合适的分配系数；固定相能实现足够高的保留值等。综合以上条件，选择表1中几种溶剂体系进行实验。

表1 溶剂体系

首先采用薄层色谱法在硅胶板上进行薄层色谱实验，计算各溶剂体系的Rf值。再称取1 mg左右的石蒜样品分别溶于10 mL各溶剂体系的上相中，使其充分溶解后进行HLPC检测，计算分配系数K(K=上相峰面积/下相峰面积)。

1.4 分离和检测方法

根据最佳溶剂体系配比配制2000 mL溶液，静置隔夜分层，超声脱气0.5 h。准确称取17.8 mg大孔树脂纯化后的石蒜样品,用3 mL下相溶液溶解，超声溶解完全，即得试样。待仪器稳定后，将试样注入色谱仪中，同时打开色谱工作站进行检测。采用标准曲线法测定石蒜碱、加兰他敏的含量。

HSCCC色谱条件：流动相体积流量为2.5 mL·min-1；转速为850 r·min-1；波长为280 nm；TC-1050型恒温循环器温度为25 ℃。

HPLC色谱条件[8]：色谱柱Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流速0.5 mL·min-1；柱温20 ℃；检测波长290 nm；流动相为磷酸缓冲溶液(pH值6.86)-乙腈(85∶15，体积比)。

2 结果与讨论

2.1 HSCCC最佳溶剂体系

各溶剂体系的Rf和K值见表2。

表2 各溶剂体系的Rf和K

如果分离组分的Rf值>0.5，说明此条件适用于分离低极性的物质。而且弱极性的有机相适于作流动相；对于极性较大的溶质Rf<0.5，则极性强的那一相可以作为流动相。

一般而言，对HSCCC最适合的K值范围是0.5～2。当K值<0.5时，出峰时间太快，峰之间的分离度较差；当K值>2时，出峰时间太长且峰形太宽，分离效果不好。

根据表2结果，选用3#溶剂体系即正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=3∶7∶3.5∶6.5(体积比)体系作为高速逆流色谱法的最佳溶剂体系。

2.2 HSCCC分离图谱(图1)

图1 石蒜中生物碱的HSCCC图谱

从图1可知，除了含有石蒜碱和加兰他敏外，大孔树脂纯化后的石蒜样品中还有其它生物碱，3个峰虽未彻底分开，但分离效果已很明显。其中，A峰出峰时间为63.15～73.22 min，B峰出峰时间为76.21～86.89 min，C峰出峰时间为96.83～108.08 min，分别收集峰A、B和C所对应的组分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。

2.3 石蒜碱与加兰他敏标准品HPLC图谱

准确称取石蒜碱标准品0.0030 g、加兰他敏标准品0.0021 g，加5 mL色谱纯甲醇溶解完全，进行HPLC检测，进样量为20 μL，结果见图2。

图2 混合标准品的HPLC图谱

从图2可知，石蒜碱出峰时间在6.4 min左右，加兰他敏出峰时间在13.9 min左右。在该HPLC条件下，两种物质能同时检测。

2.4 HSCCC分离后石蒜碱与加兰他敏的HPLC图谱

收集HSCCC分离出的组分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，浓缩至小体积，冷冻蒸发后用色谱纯甲醇溶解完全，分别进行HPLC检测，结果见图3。

图3 HSCCC中组分Ⅰ(a)、Ⅱ(b)、Ⅲ(c)的HPLC图谱

图3a中组分Ⅰ的出峰时间为6.5 min左右，对照标准品图谱可知，此峰为石蒜碱的色谱峰。表明HSCCC在63.15～73.22 min时间段内分离出的物质为石蒜碱；测得其纯度为95.36%。

图3b中组分Ⅱ的出峰时间为13 min左右，对照标准品图谱可知，此峰为加兰他敏的色谱峰。表明HSCCC在76.21～86.89 min时间段内分离出的物质为加兰他敏；测得其纯度为91.67%。

由图3c可看出，HSCCC在96.83～108.08 min时间段内分离出的物质不纯，是纯化后除石蒜碱和加兰他敏外的其它物质。

3 结论

采用高速逆流色谱法分离野生石蒜中石蒜碱和加兰他敏的最佳溶剂体系为：正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=3∶7∶3.5∶6.5(体积比)，分离后石蒜碱的纯度为95.36%，加兰他敏的纯度为91.67%。HSCCC法可同时将石蒜总碱中石蒜碱和加兰他敏分离，分离效果良好，是分离石蒜属植物中生物碱较理想的方法。

参考文献：

[1] 赵明明,熊海蓉,李霞,等.石蒜属植物中石蒜碱的研究进展[J].河南化工,2010,27(10):25-28.

[2] 李霞,熊远福,文祝友,等.大孔吸附树脂纯化石蒜中石蒜碱[J].应用化学,2009,26(3):325-328.

[3] 赵明明,熊海蓉,李霞.石蒜中石蒜碱的超声波提取研究[J].化学与生物工程,2011,28(8):33-35.

[4] 李霞,熊远福,蒋利华,等.石蒜属植物中加兰他敏的化学研究进展[J].湖南农业大学学报,2006，32(1):57-60.

[5] 李子璇,江海,曹小勇,等.石蒜植株中加兰他敏的分布与含量测定[J].江苏农业科学，2009,(3)：290-292.

[6] 李霞,熊远福,蒋利华,等.一步法提取石蒜中加兰他敏和石蒜碱[J].化工进展,2008，27(6):904-907.

[7] 耿敬章,徐福星.生物碱的生理功能及其提取分离研究进展[J].粮食与油脂,2007,10(4):44-46.

[8] 李霞,熊海蓉,蒋利华,等.HLPC法同时测定石蒜中加兰他敏和石蒜碱[J].应用化学,2010,27(11)：362-364.