山楂中黄酮类化合物提取工艺条件优化

韩秋菊

(辽宁石油化工大学环境与生物工程学院，辽宁 抚顺 113001)

山楂为蔷薇科植物山楂的成熟果实，为药食两用中药，性微温，味酸甘，具有消积食、健脾胃、行气散淤等功效。山楂中含有30多种生物活性物质，其中黄酮类化合物是主要的活性成分[1～3]，提取山楂中黄酮类化合物是提高山楂利用率的新途径。乙醇浸提法工艺简单、易于推广，广泛应用于黄酮类化合物的提取。作者在此对乙醇浸提法提取山楂黄酮的工艺条件进行优化，拟为更充分地开发利用山楂资源提供理论基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

山楂，产自辽宁营口。

芦丁标准品，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，无水乙醇。

UV757CRT型紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；205-2A型低速离心机，北京医用离心机厂；电子精密天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司；FW800型高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 方法

准确称取芦丁标准品0.2 g，用少量乙醇溶解后，用50%(体积分数，下同)乙醇定容到100 mL，得到浓度为2 mg·mL-1的芦丁标准溶液。取10 mL该标准溶液，用50%乙醇定容到100 mL，得到浓度为0.2 mg·mL-1的芦丁标准溶液。分别量取0.2 mg·mL-1的芦丁标准溶液0.5 mL、1.0 mL、3.0 mL、5.0 mL、7.0 mL、9.0 mL、13.0 mL、17.0 mL、23.0 mL置于100 mL容量瓶中，加5%(质量分数)亚硝酸钠溶液1.0 mL放置6 min，再加10%(质量分数)硝酸铝溶液1.0 mL放置6 min，最后加4%(质量分数)氢氧化钠溶液10.0 mL，用50%乙醇定容，放置10 min。以50%乙醇为空白对照，采用紫外可见分光光度计在508 nm处测定吸光度，绘制标准曲线，如图1所示。

图1 芦丁溶液的标准曲线

1.2.2 山楂黄酮的提取

按以下步骤提取山楂黄酮：山楂→去核→烘干→粉碎→脱色→烘干→称重→乙醇浸提→山楂黄酮。按下式计算黄酮类化合物提取率：

式中：x为样品总黄酮浓度，mg·mL-1；V为定容体积，mL；10为稀释倍数；W为样品质量，g。

1.2.3 提取工艺条件优化

首先以提取率为考核指标，固定其它条件不变，通过单因素实验分别考察料液比(g∶mL，下同)、乙醇体积分数、提取时间、提取温度对提取率的影响；然后在单因素实验的基础上，进行L9(34)正交实验，以确定最优工艺条件。

1.2.4 黄酮类化合物的含量测定

这是表现芭蕉“风雅的闲寂”的名句，历来被看作最具有禅宗境界的一首俳句。古池乃是永恒的形象化，永恒即“静”即“寂灭”。蛙乃大自然中的纷繁现象之一，是假象，是无常。跃入古池发出水声后，一切复归平静。短暂的“动”对照出生命的本体——寂灭。

采用NaNO2-Al(NO3)3显色法测定提取液中黄酮类化合物的含量[4]。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 料液比对山楂黄酮提取率的影响

按不同的料液比加入80%乙醇溶液于40 ℃下提取4 h，考察料液比对山楂黄酮提取率的影响，结果见图2。

图2 料液比对提取率的影响

由图2可看出，随着料液比的减小(即溶剂量的增加)，山楂黄酮的提取率逐渐升高；当料液比达到1∶50后，提取率趋于稳定。因此，从降低费用、节省能源等方面考虑，料液比选择1∶50较为适宜。

2.1.2 乙醇体积分数对山楂黄酮提取率的影响

按料液比1∶50加入不同体积分数的乙醇溶液，在40 ℃下提取4 h，考察乙醇体积分数对山楂黄酮提取率的影响，结果见图3。

图3 乙醇体积分数对提取率的影响

由图3可看出，随着乙醇体积分数的增大，山楂黄酮的提取率逐渐升高；当乙醇体积分数为70%时，提取率达到最高；继续提高乙醇体积分数，提取率反而下降。这是因为，乙醇体积分数过低，提取不完全，导致提取率较低；乙醇体积分数过高，提取液中杂质含量增多，也导致提取率下降。因此，乙醇体积分数选择70%较为适宜。

2.1.3 提取时间对山楂黄酮提取率的影响

按料液比1∶50加入70%乙醇溶液，在40 ℃下提取不同时间，考察提取时间对提取率的影响，结果见图4。

图4 提取时间对提取率的影响

由图4可看出，山楂黄酮的提取率随提取时间的延长先升高后降低；当提取时间为6 h时，提取率达到最高。因此，提取时间选择6 h较为适宜。

2.1.4 提取温度对山楂黄酮提取率的影响

按料液比1∶50加入70%乙醇溶液，在不同温度下提取6 h，考察提取温度对山楂黄酮提取率的影响，结果见图5。

图5 提取温度对提取率的影响

由图5可看出，随着提取温度的升高，山楂黄酮的提取率先升高后降低；当提取温度为50 ℃时，提取率达到最高。从热力学角度分析，提取温度越高越有利于黄酮类化合物的溶出，但提取温度过高时杂质易溶出，同时乙醇的挥发不利于黄酮类化合物的溶出，且高温会破坏黄酮类化合物。因此，提取温度选择50 ℃较为适宜。

2.2 正交实验结果

在单因素实验的基础上，选择料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度为考察因素，提取率为考核指标，进行L9(34)正交实验，其因素与水平见表1，结果与分析见表2，方差分析见表3。

表1 正交实验因素与水平

表2 正交实验结果与分析

由表2可知，各因素对山楂黄酮提取率的影响大小依次为：D>B>A>C，即提取温度>乙醇体积分数>料液比>提取时间。乙醇浸提法提取山楂黄酮的最佳工艺条件是A3B2C3D2，即料液比1∶60、乙醇体积分数70%、提取时间7 h、提取温度50 ℃。

表3 正交实验方差分析

由表3可知，料液比、乙醇体积分数、提取温度对山楂黄酮提取率影响均显著。

2.3 验证实验

在最佳工艺条件(料液比1∶60、乙醇体积分数70%、提取时间7 h、提取温度50 ℃)下，进行3次平行实验，提取率分别为2.69%、2.88%、2.84%，平均提取率为2.80%，说明该提取工艺效果较好、稳定可靠，适合于提取山楂黄酮。

3 结论

通过单因素实验和正交实验确定乙醇浸提法提取山楂黄酮的最佳工艺条件为：料液比1∶60(g∶mL)、乙醇体积分数70%、提取时间7 h、提取温度50 ℃，在此条件下提取率达到2.80%，提取效果稳定。

[1] 周巧霞，顾明，王文祥，等．不同方法提取的山楂叶总黄酮含量的测定[J]．苏州大学学报(医学版)，2002，22(2)：164.

[2] 孙立立，谢鸿霞，孙敬勇，等．比色法测定山楂中总黄酮的含量[J]．中成药，2001，23(10)：748-750.

[3] 刘北林，董继生，倪小虎，等．山楂黄酮提取及降血脂研究[J]．食品科学，2007，28(5)：324-327.

[4] 郭亚键，范莉，王晓强，等．关于NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法测定总黄酮方法的探讨[J].药物分析杂志，2002，22(2)：97-99.