苗药观音草总皂苷的大孔树脂纯化工艺研究

刘 亮， 杜 江， 陈东林， 丁丽娜， 冯 华

(1.遵义医药高等专科学校，贵州遵义563002;2.贵阳中医学院，贵州贵阳550002;3.遵义市药品检验所，贵州遵义563000)

观音草Reineckia carnea(Andr.)Kunth为百合科植物吉祥草的带根全草，又名结实兰，竹叶草，佛顶珠，小青胆，是一味著名的苗药。苗医药理论认为其药性为性冷，质征为气微味甜，入热经，走肺、肝二架，表、中、里三关。治疗肺热咳嗽、跌打损伤、疮毒等。查阅文献发现观音草在工艺优选方面的研究极少，难以进行深入开发。因此，建立观音草中总皂苷的提取纯化工艺具有十分重要的现实意义。本实验探讨了不同型号大孔树脂对分离纯化观音草总皂苷的影响，在此基础上优选出总皂苷的最佳纯化工艺。

1 仪器与试药

UV75-18可见分光光度计 (天津市拓普仪器有限公司);DHG 90AOA型电热恒温鼓风干燥箱 (宁波江南仪器厂);Senco R系列旋转蒸发仪 (上海申生科技有限公司);FY130型药物粉碎机 (天津市泰斯特仪器有限公司);DKS-26型电热恒温水浴锅 (宁波江南仪器厂)。

薯蓣皂苷对照品购于上海华壹生物科技有限公司 (批号:19057-60-4);观音草药材采集于贵州遵义，经遵义医药高等专科学校张学愈副教授鉴定为百合科植物观音草Reineckia carnea(Andr.)Kunth;大孔树脂 HPD100，HPD200A，HPD300，HPD700，D101(沧州宝恩化工有限公司);其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 观音草总皂苷定量分析方法的建立及样品溶液预处理方法 精密称取薯蓣皂苷对照品1.2 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。分别精密移取薯蓣皂苷对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL置于10 mL具塞试管内，挥干甲醇，再分别加入5%的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，摇匀，密塞，60℃水浴显色15 min，取出后立即用冰水冷却5 min，再加入5 mL冰醋酸稀释，摇匀，静置10 min，于460 nm处测定其吸光度。以吸光度 (A)为纵坐标，质量浓度 (C)为横坐标进行线性回归。结果表明，薯蓣皂苷在4～24 μg/mL与吸光度呈良好的线性关系。回归方程为 A=0.019121C+0.006133，r=0.9995［1］。

大孔树脂分离工艺中所得的观音草总皂苷洗脱流份，回收乙醇至干，用蒸馏水溶解并定容至100 mL，准确吸取10 mL于分液漏斗中，用水饱合正丁醇分4次萃取(15、10、10、10 mL)，正丁醇萃取液用正丁醇饱和的水20 mL洗涤，减压回收正丁醇至干，残渣用甲醇溶解并定容于25 mL量瓶中，按上述紫外分光光度法进行总皂苷的含有量测定。

2.2 供试液的制备 称取观音草药材粗粉50 g，用8倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液回收乙醇至干，加蒸馏水溶解并定容至200 mL，用石油醚分6次萃取 (300、200、200、200、200、200 mL)，弃去石油醚液，水溶液过滤，定容至500 mL。

2.3 大孔吸附树脂的预处理 分别称取5种型号 (D101，HPD100，HPD200A，HPD300，HPD700)的大孔吸附树脂用95%乙醇浸泡24 h，装柱，用95%乙醇洗至1 mL洗脱液与3 mL蒸馏水混合澄清为止，再用蒸馏水洗至无醇，备用。2.4 不同型号大孔树脂的静态吸附及解析的研究 分别称取经预处理的各型号的树脂0.5 g置于锥形瓶中，加入供试液30 mL，每隔10 min振摇30 s，持续2 h，静置24 h后，抽滤，得吸附后的滤液。将吸附后的树脂置于锥形瓶中，加入70%乙醇30 mL，其余操作同上，得解吸后的滤液。按2.1项下操作并进行总皂苷的含有量测定，计算树脂对总皂苷的静态饱和吸附量，洗脱量及洗脱率［2］。结果见表1。

表1 5种树脂静态饱和吸附量及静态洗脱率

由表1结果可知，各树脂饱和吸附量，洗脱量及洗脱率相差较大，综合考虑3个因素，后续实验确定选择HPD100型大孔吸附树脂进行分离纯化观音草总皂苷的工作。

2.5 HPD100大孔吸附树脂的上样吸附时间考察 分别准确称取0.5 g预处理过的HPD100大孔吸附树脂置于6个100 mL锥形瓶中，加入供试液30 mL，摇匀，分别静止吸附0.5、1、2、4、6、8 h，过滤，滤液按2.1项下操作并进行总皂苷的含有量测定，计算各吸附液中总皂苷的吸附量达饱和吸附量的比率。结果见图1。

图1 HPD100大孔吸附树脂上样吸附时间考察

如图1所示，当吸附时间达到8 h时，树脂静态吸附量达到73.79 mg，达饱和吸附量的86.25%。吸附时间在2 h之前，观音草总皂苷的吸附率提高较明显，而2 h之后则无明显增加，故确定上样吸附时间定为2 h，可在较短时间内达到较高的吸附效率［3］。

2.6 HPD100大孔吸附树脂的动态吸附量的考察 准确称取4 g预处理过的HPD100大孔吸附树脂，共3份，湿法装柱。准确吸取供试液 160 mL，上样预吸附 2 h后，以3 BV/h的体积流量进行吸附，吸附结束后，再用蒸馏水8BV以5BV/h的体积流量洗脱至近无色，合并过柱液及水洗液并定容至250 mL，按2.1项下操作并进行总皂苷的含有量测定，结果平均动态吸附容量为55.33 mg/g(n=3)，RSD为1.22%。

2.7 HPD100大孔吸附树脂洗脱溶剂浓度的考察 准确称取4 g预处理过的HPD100大孔吸附树脂，湿法装柱。准确吸取供试液80 mL，上样预吸附2 h，之后，以3 BV/h的体积流量进行吸附，吸附结束后，再用蒸馏水8 BV以5 BV/h的体积流量洗脱至近无色，再依次用15%、30%、50%、70%、90%乙醇各4 BV洗脱，洗脱体积流量为3 BV/h，分别收集各浓度段洗脱液，按2.1项下操作并进行总皂苷的含有量测定，计算洗脱量及洗脱率。结果见表2。

表2 洗脱溶剂浓度考察

由表2可以看出，观音草总皂苷主要集中在50%乙醇洗脱液中，而70%乙醇洗脱液中总皂苷相对较少，从节约成本考虑，可以选择50%的乙醇进行洗脱，但实际操作过程中50%乙醇是否能有效地将总皂苷完全洗脱下来，还应比较50%及70%乙醇的洗脱效率。

2.8 HPD100大孔吸附树脂洗脱溶剂用量的考察 准确称取4 g预处理过的HPD100大孔吸附树脂，共2份，湿法装柱。准确吸取供试液80 mL，上样预吸附2 h后，以3 BV/h的体积流量进行吸附，吸附结束后，再用蒸馏水8 BV以5 BV/h的体积流量洗脱至近无色，再分别选用50%及70%乙醇以3 BV/h的体积流量洗脱6 BV，每1 BV收集1份，按2.1项下操作并进行总皂苷的含有量测定，计算洗脱量及洗脱率。结果见表3。

表3 洗脱溶剂用量的考察

由表3可以看出，70%乙醇洗脱用量达到3 BV时，即可将总皂苷完全洗脱下来，而50%乙醇需要5 BV才能将总皂苷完全洗脱下来，故综合表2及表3确定洗脱含乙醇量为70%，洗脱用量为3 BV。

2.9 HPD100大孔吸附树脂吸附及洗脱速度的考察 准确称取4 g预处理过的HPD100大孔吸附树脂，共5份，湿法装柱。准确吸取供试液80 mL，上样预吸附2 h，吸附完成后，用蒸馏水8 BV以5 BV/h的体积流量洗脱至近无色，再用70%乙醇3 BV洗脱，体积流量 (吸附及解吸附)分别选用1.5、3、5、7、9 BV/h，收集70%乙醇洗脱液，按2.1项下操作并进行总皂苷的含有量测定，计算洗脱量及洗脱率。结果见表4。

表4 吸附及洗脱体积流量的考察

由表4可以看出，随着体积流量的增加，洗脱率有明显的降低，从79.82%逐渐降低至47.59%，因此片面增加体积流量并不能提高总皂苷的洗脱效率，应选择1.5 BV/h较为适宜。

2.10 工艺验证实验 准确称取4 g预处理过的HPD100大孔吸附树脂，共3份，按以上工艺优化实验结果进行实验并按2.1项下操作进行总皂苷的含有量测定，计算洗脱量、洗脱率、总皂苷得率。结果见表5。

表5 工艺验证实验

由表5可知，70%乙醇流分中总皂苷的洗脱率稳定，平均达到80.21%(n=3)，平均总皂苷得率2.11%。因此该工艺较为稳定，洗脱率较高，可以用于工业化生产。

3 讨论

大孔树脂在装柱前应当按预处理方法处理好，否则会影响分离效果;同时还应注意湿法装柱时应尽量将气泡除去，以免柱子出现断层;加入供试液时，应缓缓加入，防止树脂冲起，影响分离效果。由于皂苷具有很强的发泡性，故在浓缩过程中应时刻注意，避免浓缩液冲出，影响实验结果的准确性。

目前采用大孔吸附树脂技术分离、纯化药材皂苷类有效部位的研究较多［4-12］。本实验在参考文献的基础上，通过一系列工艺参数的优化研究，首次建立起大孔吸附树脂分离纯化观音草中总皂苷的工艺路线，其具体工艺参数为:选用HPD100型号大孔吸附树脂装柱，上样吸附时间为2 h，采用70%乙醇3 BV进行洗脱，体积流量为1.5 BV/h。通过验证实验证实，该工艺路线稳定可行，可为观音草的生产应用提供可靠的理论依据。

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