去卵巢大鼠肾脏组织表达FSHR和LHR

张 哲，郑清莲，刘永惠

(西安交通大学医学院第一附属医院中医科，陕西西安 710061)

近年来发现，卵泡刺激素受体(follicle-stimulating hormone receptor，FSHR)、黄体生成素受体(luteinizing hormone receptor，LHR)可存在于性腺外组织如:脂肪［1］、骨组织［2］、平滑肌细胞、胃的壁细胞［3］、胰腺［4］、颌下腺［5］、某些恶性肿瘤细胞表面［6］等。

本实验曾发现［7－8］正常大鼠肾脏组织中有FSHR、LHR的表达，且表达量、基因序列与卵巢组织一致，那么是否具有和卵巢组织相似的表达调控特性?本实验旨在研究肾脏组织中FSHR、LHR的表达调控特性，从而探讨肾脏是否具有和卵巢相似的功能和变化。

1 材料与方法

1.1 材料

清洁级SD雌性大鼠54只，未交配，体质量为200～220 g，普通级;孕19～21 d的SD雌性大鼠共100只［西安交通大学医学院动物中心提供合格证号:SCXK(陕)2008-002］。RNAfast200(广州飞捷生物有限公司);反转录试剂盒(Fermentas公司);RT-PCR反应体(广州东盛生物科技有限公司);Quantityone分析软件凝胶分析系统(Bio-Rad公司);放免试剂盒(天津九鼎生物制品公司);苯甲酸雌二醇(西安化学试剂厂)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备及分组:30只行双侧卵巢摘除手术，余24只行假手术。

采用阴道细胞学检查方法，阴道分泌物进行HE染色，普通光学显微镜观察。证实卵巢摘除成功。

假手术组分为N1、N2和N3组各8只，模型组分为M1、M2和雌激素干预组各10只。N1组术后5日检测相关指标。N2和M1组术后1月检测相关指标。N3、M2和E组术后1月开始给药:E组每周2次肌肉注射苯甲酸雌二醇(0.1 mL/kg)，给药结束即检测指标。

1.2.2 放免法测各组血清LH、FSH、E2和P水平:常规分离血清，4℃保存备用。加入相应抗体，混匀，37℃温育1 h，加入分离剂再混匀，4℃放置10 min，吸取上清液，测定放射性计数(counts/min)，计算LH、FSH、E2和P含量。

1.2.3 RT-PCR检测各组肾脏组织FSHR mRNA、LHR mRNA相对表达量:剪切肾脏皮质组织。根据Primer 5.0软件设计并合成扩增引物;用fast法提取组织RNA;cDNA反转录反应体系及条件:随机引物，DEPC-treated 水，5 × 反应缓冲液，dNTPmix，核糖核酸酶抑制因子，RevertiAid M-MuLV反转录酶;PCR扩增体系:2×PCR TapMix，模板，上下游引物，DEPC水;FSHR反应条件:预变性94℃ 3 min，扩增条件94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环，末次延伸72℃ 10 min。LHR反应条件:预变性94℃ 3 min，扩增条件94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72℃30 s，35个循环，末次延伸72℃ 10 min。产物凝胶电泳，EB染色，观察并照相。

1.3 统计学分析

Bio-Rad凝胶图像分析系统测定PCR产物的吸光度值，并与各自内参相比。用SPSS 16.0进行统计学处理，所得数据用均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 阴道涂片结果

对照组阴道脱落细胞以多边形表层细胞为主，胞质红染，胞核致密;模型组阴道脱落细胞以圆形底层细胞为主，胞质蓝染，颜色较深，胞核位于细胞中心，呈网状(图1)。

2.2 放免法测各组大鼠血清性激素水平变化

与N1组比较，M1组在术后1月E2、P水平显著下降(P＜0.01)，M2组在术后2月E2、P有所升高，尤以P升高明显(P＜0.01);与N1组比较，M1组在术后1月FSH、LH水平明显升高(P＜0.05)，M2组FSH水平逐渐下降，但LH水平仍继续升高(表1)。±s)

图1 大鼠阴道脱落细胞涂片观察(HE×100)Fig 1 The vaginal smears of group A and B(HE×100)

表1 各组大鼠血清性激素水平Table 1 The serum levels of sex hormones(

2.3 RT-PCR半定量检测各组大鼠肾脏FSHR mRNA、LHR mRNA相对表达量变化

与N1组比较，M1组在术后1月FSHR mRNA、LHR mRNA相对表达量明显下降(P＜0.05)，M2组在术后2月FSHR mRNA、LHR mRNA相对表达量继续下降，尤以FSHR mRNA下降明显(P＜0.05)，M1组显著高于M2组 (P＜0.05)(表2，图2)。

表2 各组大鼠肾脏组织中FSHR mRNA、LHR mRNA相对表达量Table 2 The relative expressions of FSHR and LHR mRNA in rat kidney(±s)

表2 各组大鼠肾脏组织中FSHR mRNA、LHR mRNA相对表达量Table 2 The relative expressions of FSHR and LHR mRNA in rat kidney(±s)

*P＜0.05 compared with group N1;#P＜0.05 compared with group M1;△P＜0.05 compared with group M2.

group amount FSHR mRNA LHRmRNA N1 8 0.916±0.175 0.223±0.065 N2 8 0.908±0.136 0.226±0.029 M1 10 0.801±0.634* 0.146±0.111*N3 8 0.911±0.144 0.221±0.058 M2 10 0.777±0.294# 0.137±0.051#E 10 0.514±0.249△0.136±0.061

3 讨论

慢性肾功能衰竭(chronic renal failure，CRF)时会发生性激素水平降低的病理变化，众多学者普遍认为其是通过影响下丘脑-垂体-性腺轴形成的。

有报道［13］肾衰患者发生排卵障碍和月经紊乱等，与肾衰的严重程度相平行，他们测定了肾衰透析与未透析两组患者及健康献血者血清FSH、PRL、E2、P和LH的水平。结果提示，透析并不能改善肾衰患者的内分泌状况。同时又有报道［9］，给予肾衰血液透析患者促性腺激素释放激素或拘椽酸克罗米芬后，血清LH及FSH水平相应地增高，提示下丘脑-垂体功能未受损害。

图2 各组大鼠肾脏组织中FSHR和LHR mRNA表达Fig 2 The FSHR and LHR mRNA expression in rat kidney

由此，如果是毒素影响下丘脑以及性腺的功能，而CRF患者下丘脑-垂体功能本身未受损害，那么规律血液透析后其内分泌状况为什么没有改善，而肾移植术后，患者的性激素水平明显提高、性功能也得到了恢复?所以毒素影响学说以及下丘脑-垂体-性腺轴功能的紊乱已经不能为肾衰性激素水平减退做出合理的解释，因此要寻求其他作用途径来明确这一现象，但目前国内外对此研究甚少。

前期的实验研究首次发现正常大鼠肾脏中有FSHR和LHR的表达，且其表达量、基因序列与卵巢组织一致;且国外研究报道大鼠肾脏组织中存在参与和调节性激素合成的 17β-HSDs［10］、StAR 及SF-1［11］因子;并有实验检测到大鼠肾脏中有性激素的分泌［12］，据此设想，肾脏是否具有和卵巢组织相似的内分泌功能，从而参与性激素合成和调节过程?并进行了相关实验研究。

本研究发现在大鼠肾脏和卵巢中，FSH和LH对其受体表达的双相调节是一致的。低剂量FSH和LH提高FSHR mRNA和LHR mRNA水平;而高剂量FSH和LH下调FSHR mRNA和LHR mRNA水平。高剂量的雌激素可导致FSHR mRNA水平的显著下降。

大鼠肾脏中的FSHR和LHR的表达量、基因序列以及表达调节特性与卵巢组织极为相似，说明肾脏组织有可能通过FSHR、LHR，参与性激素合成和调节过程，但其是通过什么途径参与和调节的?推测肾脏自身是否存在一条类似下丘脑-垂体-性腺的调节轴(The hypothalamus pituitary gonadal axis，HPGA)参与性激素的合成与代谢过程。本研究结果不但能丰富肾脏的生理功能，还为治疗肾衰性激素水平减退提供新的思路和方法。

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