以铕离子为荧光探针测定痕量环丙沙星

苗延虹

(山东农业大学化学院，山东泰安 271000)

1 前言

环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)是喹诺酮类药物中的第三代产品——氟喹诺酮类药物。别名丙氟哌酸，悉复欣、环丙氟哌酸，结构见下图:

环丙沙星具备广谱抗菌活性，杀菌效果好，具有高效、低毒以及口服吸收完全、体内分布广、不易产生抗药性等特点，是目前最佳的抗感染药物之一。除用于人医临床外，已进入兽用领域。主要用来预防和治疗动物疾病［1，2］，广泛应用于畜禽、水产养殖中。因此建立可靠、灵敏、简便、快速的测定方法对于研究环丙沙星的药理，临床医学和生物残留具有重要的实际意义。

有关环丙沙星的分析方法，文献报道的有高效液相色谱法［3，4］、分光光度法［5］、原子吸收光谱法［6］和电分析方法［7，8］、液相色谱－串联质谱法［9，10］、荧光光谱分析法［11－14］等。其中荧光分析法是一种灵敏度高、选择性好、简便快速的分子发射光谱分析法。

图1 环丙沙星结构图Fig.1 Structure of Ciprofloxacin

本文利用荧光光谱和吸收光谱研究了Eu3+、CIP与SDS的相互作用。环丙沙星是Eu3+的理想配体，所生成的二元配合物通过分子内能量转移，使Eu3+激发，并发射其位于615 nm的特征荧光，具有荧光量子产率高、Stokes位移大、发射峰窄以及荧光寿命长的优点。加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)后，铕离子位于615 nm处的特征荧光能够被显著增强。据此，本文以Eu3+作为荧光探针，建立了一种测量环丙沙星的新方法。该方法灵敏度高、选择性好、干扰少、操作简单，用于实际样品的测定，结果令人满意。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

2.1.1 仪器 UV－240型紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，Cary Eclipse荧光分光光度计(美国VARIAN公司)，pHS－3精密酸度计(上海自动化仪表有限公司)。

2.1.2 试剂 针剂乳酸环丙沙星氯化钠注射液(山东鲁抗辰欣药业有限公司，国药准字H2004598，0.2 g*100 mL/瓶，样品1);盐酸环丙沙星片剂(莱阳市江波制药有限责任公司250 mg∕片，按环丙沙星计，样品2);

氧化铕Eu2O3(99.99%，上海晶纯试剂有限公司);β－环糊精(上海晶纯试剂有限公司，99%);分析纯;十六烷基三甲基溴化铵CATB(天津市巴斯夫化工有限公司，分析纯);曲拉通X－114;十二烷基硫酸钠(SDS，天津市巴斯夫化工有限公司):准确称取一定量SDS，溶于水得浓度为7.299×10－2mol·dm－3的储备液。使用前以石英亚沸蒸馏水稀释即得7.299×10－4mol·dm－3的工作液;环丙沙星储备液(中国药品生物制品检定所):准确称取一定量环丙沙星，以石英亚沸蒸馏水溶解定容得2.460×10－2mol·dm－3的储备液。使用时以石英亚沸蒸馏水逐级稀释即得工作液(2.460×10－4mol·dm－3);Eu3+储备液:准确称取2.3280 g Eu2O3(99.99%)，加入少量浓盐酸，再加入少量过氧化氢，缓慢加热使其溶解，并挥发近至干，然后用0.1 mol·dm－3的稀盐酸稀释至100 mL，作为储备液，使用时以石英亚沸蒸馏水稀释即得工作液(6.615 ×10－3mol·dm－3);0.01 mol·dm－3Tris－HCl缓冲溶液，pH=8.02。

以上储备液与工作液均需置于0～4℃的生化培养箱内保存。所有试剂均为分析纯，实验用水均为石英亚沸二次蒸馏水。

2.2 实验方法

于 10 mL比色管中依次加入1 mL pH=8.02 的 Tris– HCl(0.01 mol·dm－3)缓冲溶液、1.0 mL 2.460 ×10－4mol·dm－3环丙沙星、1.0 mL 7.299 ×10－4mol·dm－3SDS 和 1.0 mL 6.615 ×10－3mol·dm－3Eu3+，再用石英亚沸蒸馏水定容至刻度10.0 mL，振荡摇匀，放置40 min，记录其荧光光谱。在λex/λem=265 nm/615 nm，(激发和发射通带均为5 nm)处，用1 cm石英荧光液池，测定溶液的相对荧光强度F，同时测定试剂空白F0。

3 结果与讨论

3.1 荧光光谱与吸收光谱

按照实验方法，绘制Eu3+、CIP、CIP－Eu3+和CIP－Eu3+－SDS的发射光谱(见图2)。

由曲线1可以看出，单独的Eu3+水溶液不能检测到Eu3+的特征光谱。比较曲线3和曲线4可看出，当在Eu3+溶液中加入CIP后，CIP在429 nm处的发射强度明显降低，并出现595 nm和615 nm较强的Eu3+的特征荧光峰，分别对应于Eu3+的5D0→7F1，5D0→7F2的跃迁。说明CIP和Eu3+生成二元配合物，通过分子内能量转移过程，使Eu3+激发，并发射铕离子强的特征荧光，曲线2由于表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)的加入，改善了Eu3+与CIP的配位微环境，减少了水分子与络合物的结合，使体系的荧光强度大约增强3倍。

CIP、CIP－Eu3+、CIP－Eu3+－SDS的吸收光谱见图3，比较曲线1和曲线2，发现在CIP中加入Eu3+后，吸光度降低，发生红移，说明生成二元配合物。比较曲线2和曲线3，发现在CIP－Eu3+体系中加入SDS后，峰位未变，吸光度增强，这是由于胶束的保护作用，减少了发光离子激发态无辐射去活造成的能量损失，使体系的荧光量子产率提高，荧光强度进一步增强。

3.2 影响体系荧光强度的因素

3.2.1 体系酸度对荧光强度的影响 CIP分子中含有3－羧基－4－氧喹诺酮环系，7位有一个哌嗪取代基(图1)，分子中的N原子与O原子在不同酸碱度溶液中的质子化程度将直接影响发光体系电子的性质以及电子云分布［15］。因此溶液的pH值会对体系的荧光强度产生较大的影响。

在 pH值7.26～8.42的范围内测定了CIP－Eu3+－SDS体系的荧光强度，结果见图4。如图所示，pH=8.02时，体系的荧光强度最强，说明在此酸度下有利于形成稳定的发光配合物。固定pH值为8.02，实验了(CH2)6N4－HCl、NH4Cl－NH3、Tris－HCl、NH4A c－HAc四种不同的缓冲溶液对体系荧光强度产生的影响，结果表明，在Tris－HCl体系中Eu3+敏化荧光强度最大且稳定，因此选择浓度为0.01 mol·dm－3pH=8.02的Tris–HCl缓冲溶液做进一步的研究。

图4 缓冲溶液酸度对荧光强度的影响Fig.4 The influence of pH on F

3.2.2 缓冲溶液用量对 CIP－Eu3+－SDS体系荧光强度的影响 在pH=8.02条件下，探讨了缓冲溶液的用量对体系荧光强度的影响，如下图所示:

由图5可知，Tris－HCl缓冲溶液的加入量为0.5～2.0 mL时，荧光强度最大且基本稳定，故本文选择加入1.0 mLTris–HCl缓冲溶液(0.01 mol·dm－3)做进一步的研究。

3.2.3 加入顺序对体系荧光强度的影响 在同样的浓度条件下 ，按缓冲溶液、环丙沙星、Eu3+、SDS的顺序加入时，体系的荧光强度F最大，加入稳定性也更好 ，稳定时间更长。说明这个加入顺序最有利于配合物的生成，故本文选择上述加入顺序。

3.2.4 表面活性剂的种类及用量的影响 实验了不同的表面活性剂Triton X－114、β－环糊精、SDS、CATB对体系的增敏作用。其中，Triton X－114、β－环糊精、CATB对体系无增敏作用，只有SDS的增敏效果最好。分析原因主要是稀土离子络合物带正电荷，而SDS是阴离子表面活性剂，带有负电荷，两者更容易结合。SDS的浓度为7.299×10－5mo l·dm－3时，其用量为1.0 mL最佳。如图所示:

3.2.5 环丙沙星和Eu3+浓度的影响 环丙沙星和Eu3+的浓度对CIP－Eu3+－SDS体系荧光强度(F)的影响见图7。由图7可知，CEu3+:CCIP在10～40的范围内时，体系的荧光强度稳定且荧光强度F最大。故本文选择 CEu3+:CCIP=27:1(即浓度为 2.460 ×10－4mol·dm－3的环丙沙星 1.0 mL，浓度为 6.615 ×10－3mol·dm－3的 Eu3+1.0 mL)进行下一步研究。

图7 环丙沙星和Eu3+的浓度对体系F的影响Fig.7 Effect of CIP concentration and Eu3+concentration on F

3.2.6 反应时间对体系荧光强度的影响 反应时间对体系的荧光值有较大的影响，由图8可知体系在40 min后荧光值基本达到稳定，故本文选择40 min后开始测定。

图8 反应时间对体系的荧光强度的影响Fig.8 Effect of reaction time on the fluorescence intensity of system

3.2.7 测定CIP的线性范围与检出限 在最佳实验条件下，绘制了CIP校准曲线，在CIP－Eu3+－SDS体系中，CIP的浓度变化与体系在λex/λem=265 nm/615 nm处的F，呈现良好的线性关系，线性方程 Y=－59.32+9.710X，相关系数 r=0.9965，方法的线性范围 2.46 ×10－7mo l·dm－3～ 9.84 ×10－5mo l·dm－3，检出限为1.92 ×10－7mol·dm－3。

3.3 样品中 CIP的测定

取1支针剂用石英亚沸二次蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，另取2片药片，加入20% 的三氯乙酸，溶解，抽滤，滤液用石英亚沸二次蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，再分别逐级稀释至测定CIP的线性范围之内。测定结果见下表。

样品中CIP的测定Table Determination of CIP in injection and tablet samples(n=3)

由上表可以看出本方法对测定CIP含量有较好的准确性和重现性。

4 体系CIP－Eu3+－SDS荧光增强机理的探讨

环丙沙星含有A－酮酸结构，是铕离子的理想配体，而且可以通过分子内能量转移敏化铕的特征荧光。加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)后，进一步增强了体系的荧光强度。

从图2可以看出，在CIP体系中加入Eu3+后，CIP在429 nm处的发射强度明显降低，并出现595 nm和615 nm较强的Eu3+的特征荧光峰，说明发生了分子内能量转移，生成了CIP－Eu3+二元配合物。加入SDS后，生成三元配合物，更有利于能量转移。从图3也可以看出，CIP－Eu3+－SDS体系的吸收光谱与CIP－Eu3+体系的非常相似，但强度增大了。也说明生成了CIP－Eu3+－SDS三元络合物。

Eu3+是6～8个配位数的稀土离子，实验中Eu3+与CIP浓度比为27∶1，是不饱和配位，在水溶液中，CIP－Eu3+易与水分子配位形成CIP－Eu3+－(OH2)n配位结构。

CIP－Eu3+－(OH2)n配合物中的Eu3+有多余的正电荷，很容易与SDS上的十二烷基磺酸根负离子通过静电作用相互结合，另外，SDS上的十二烷基磺酸根负离子中的 O还可取代 (OH2)n与Eu3+配位生成具有紧密结构的三元配合物，伴随着放出CIP－Eu3+－(OH2)n配合物中的H2O，从而降低了水分子中O—H键振动引起的非辐射能量损失。因此，SDS的加入，减少分子内活化过程及荧光猝灭效应，使得荧光增强。

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