孕早期甲氧滴滴涕染毒对孕鼠胎盘组织ERα 基因表达的影响

王晓蓉，苑洪菲，王黎娜，于 波

环境污染物是造成不孕、流产和胎儿畸形的主要原因之一。研究发现，早期胚胎发育阶段对环境污染物更加敏感［1］，明确其致病机制，寻找有效的监测和预防手段一直为临床所关注。甲氧滴滴涕作为一种替代滴滴涕的有机氯杀虫剂目前在许多国家得到广泛应用，近年研究发现MXC 具有多方面的毒性作用，尤其以生殖毒性引人注目［2］。研究表明，MXC 是一种环境内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals，EDCs)，具有雌激素样作用，胚胎和胎儿是MXC 最敏感的靶器官之一，MXC 体内羟基代谢产物的雌激素样作用强于MXC。MXC 的毒性作用机制与ERα 密切相关，其代谢产物是ERα 的激动剂，可以通过ERα 介导产生相应的生物学效应，同时可以改变不同组织ERα 的表达水平［3，4］。然而，有关MXC 影响早期胚胎发育的研究报道较少，笔者通过构建孕鼠早期胚胎发育MXC 染毒模型，检测MXC 染毒对孕鼠胎盘组织ERα 表达的影响，探讨MXC 影响雌性生殖健康和胚胎发育的毒性作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 昆明种小鼠60 只(雌性40 只，雄性20 只)，8 周龄，平均体重(28.12 ±3.3)g，由第四军医大学实验动物中心提供，自由饮食、饮水，清洁级饲养。

1.2 试剂及仪器 MXC(批号:49054，纯度:99%，Sigma 公司)，芝麻油(批号:S3547，Sigma－Aldrich公司)、雌二醇(批号:10006315，纯度＞98%，Cayman Chemical 公司)、兔抗鼠ERα 单克隆IgG 抗体(Santa Cruz 公司)、Trizol 总RNA 抽提试剂盒(Invitrogen 公司)、RT 试剂盒(Invitrogen 公司)、DAB 显色试剂盒(武汉Boster 生物工程公司);ABI7300 Real－Time PCR 检测仪(ABI 公司)、LX70 倒置显微镜(Olympus 公司)、凝胶成像系统(UVP 公司)。

1.3 构建孕鼠MXC 染毒模型 孕鼠随机分组，每组10 只，分别为MXC 染毒组、正常对照组与阳性对照组。依据文献［5］，妊娠0.5 ～7.5 d，MXC 染毒组孕鼠皮下注射MXC 166.67mg/(kg·d)，正常对照组孕鼠皮下注射芝麻油，阳性对照组孕鼠皮下注射雌二醇(1.0 μg)。

1.4 RT－PCR 检测胎盘组织中ERα mRNA 表达 各组孕鼠剖宫产后收集胎盘组织，置入经DEPC 处理的EP 管中，于－80 ℃保存待测。依据GenBank 核酸序列数据库设计ERα 引物，由上海生物工程技术公司合成。上游引物:5'－TGT ACC TGC CTA GCA ACA GT－3'，下游引物:5'－GCC ACG TAT CTA AGT CAC CT－3'(450 bp)，内参照β－actin 上游引物:5'－GGT GGG AAT GGG TCA GAA GG－3'，下游引物:5'－CCA AGA AGG AAG GCT GGA AAA－3'(671 bp)。应用Trizol 方法提取胎盘总RNA，ERα cDNA特异性扩增与定量分析应用RT－PCR 技术。扩增条件:93 ℃1 min，56 ℃30 s，72 ℃1 min，进行1 个循环;93 ℃30 s，63 ℃30 s，72 ℃1 min，进行30 个循环;72 ℃延伸8 min。取扩增产物10 ml，5%琼脂糖凝胶电泳，UVP 凝胶成像系统进行检测，计算各条带PCR 产物凝胶电泳的光密度与相应β－actin 条带光密度的比值表示其相对表达水平。

1.5 免疫组化法检测胎盘组织中ERα 表达水平 孕鼠胎盘组织样本以4%多聚甲醛固定，30%蔗糖脱水，石蜡包埋，采用冰冻切片机制备厚度为5 μm的冷冻切片，丙酮－20 ℃固定后置于－80 ℃保存。取上述组织切片，依据免疫组化方法进行检测。

1.6 统计学处理 采用SPSS13.0 统计软件进行t检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胎盘组织中ERα mRNA 表达 ERα 在各组胎盘组织均有表达，与正常对照组ERα mRNA 的相对表达量(0.49 ± 0.09)相比，MXC 染毒组ERα mRNA 的相对表达量(0.68 ± 0.11)明显增高，差异有统计学意义(P ＜0.05);与阳性对照组ERα mRNA 的相对表达量(0.60 ± 0.10)相比，MXC 染毒组ERα mRNA 的相对表达量差异无统计学意义(P ＞0.05)。

2.2 免疫组化结果 正常对照组、MXC 染毒组与阳性对照组孕鼠胎盘绒毛滋养层细胞可见ERα 阳性表达，ERα 为胞核、胞浆阳性染色。采用Motic Images Advanced 3.2 (Motic China Group Co，LTD)图像分析系统，每张切片随机选择3 个视野(×200倍)，测量平均阳性面积(μm2)与平均光密度(OD)值，两者的乘积为免疫组化阳性指数，与正常对照组相比，MXC 染毒组孕鼠免疫组化阳性指数显著增加(P ＜0.05，图1)。

图1 孕鼠胎盘ERα(免疫组化染色，×200)

3 讨论

妊娠期胎盘雌激素的合成对胚胎的发育和妊娠的维持具有重要作用，此外雌激素与妊娠期的各个生理过程包括受精卵着床，以及分娩过程的调节密切相关。雌激素的生理学效应主要通过ERα 介导，研究发现卵裂细胞ERα 在孕鼠胚胎植入与发育期均有表达［6］。长期接触MXC 可以导致生育能力明显下降，胚胎发育早期阶段对MXC 非常敏感，笔者前期实验结果证实，早期持久性暴露MXC，孕鼠子代体重明显减轻，胎鼠数明显减少，子代出生后发育率明显降低［5］。本研究发现，ERα mRNA 在MXC染毒孕鼠胎盘组织中的表达明显增高，提示MXC 主要是以内源性雌激素样方式作用于胎盘ERα。

MXC 可以通过与ERα 的相互作用影响胚胎早期发育并间接影响胎盘环境而产生长期毒性效应。MXC 与ERα 结合后，可以减少内源性雌激素与ERα 的结合，使其不能形成ERα 二聚体，影响与DNA 启动子的雌激素反应元件结合，干扰调节靶基因转录，从而不能产生任何生物学效应，抑制小鼠植入前的胚胎发育，增加胚胎功能异常情况的发生比率，导致胚泡凋亡的高发生率，这可能是MXC 影响胚胎发育的重要作用机制之一［7，8］。目前研究发现，EDCs 还可以通过神经内分泌系统激活ERα 传导通路［9］，因此对于MXC 影响胚胎发育和雌性生殖健康的毒性作用机制还需要进一步深入研究。

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