华南农业大学天然农药与化学生物学教育部重点实验室 王秋影 廖美德*
羽毛角蛋白的主要结构是β-角蛋白,该类蛋白中存在大量的二硫键、氢键和疏水键,交联度大,不可溶,不能被常见蛋白酶所降解(Wang等,2008)。因此,这些羽毛废弃物大多未被充分利用,有的甚至污染环境,造成公害,同时也存在蛋白质资源浪费问题(Gousterova等,2005)。角蛋白酶是能够有效水解不溶性角蛋白的一类蛋白水解酶,可由一些昆虫和微生物产生(Gradiar等,2005;Suntornsuk等,2005)。利用角蛋白酶的生物方法降解羽毛角蛋白,可将羽毛等废弃角蛋白直接转变成蛋白质或复合氨基酸,变废为宝,既保护环境又可以实现资源再利用,产生显著的经济和社会效益(张启等,2008)。本文就角蛋白酶的微生物来源、生化性质、基因工程研究等方面进行探讨,以期为相关研究提供参考。
角蛋白酶主要来自具有角蛋白降解活性的微生物,包括真菌、放线菌和细菌。产生角蛋白酶的微生物品种繁多(表1),但只有很少的菌株具有商业开发价值。运用分子生物学及基因工程学手段,加强微生物表达和分泌角蛋白酶的研究,进而实现其在工业领域的应用价值,是当前该领域的热门课题之一。
表1 产角蛋白酶的菌株
在筛选羽毛角蛋白降解菌过程中发现,淡紫拟青霉PL-HN-16具有良好的羽毛降解活性(王秋影等,待发表)。淡紫拟青霉属于拟青霉属真菌。目前关于拟青霉属降解角蛋白的报道较少。谭盈盈等(2005)和Tan等(2004)从畜禽养殖场污水污泥中分离到了一株羽毛降解菌,初步鉴定为拟青霉菌株(Paecilomyces sp),并对该菌株进行了初步研究。Gradiar等(2005)研究发现,马昆德拟青霉MZKI B639可产角蛋白酶。此外,Cavello等(2012)研究报道,淡紫拟青霉LPS 876可产角蛋白酶。
角蛋白酶来源不同,其结构、理化性质、水解活性以及最佳作用底物不同。目前已发现的角蛋白酶多为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶,以丝氨酸蛋白酶居多。根据其最佳作用pH,可以把角蛋白酶分为酸性酶和碱性酶,大多角蛋白酶属于碱性酶。角蛋白酶大多属于胞外酶,少数属于胞内酶,如鸡禽毛癣菌(Trichophytongallinae)角蛋白酶(李明珠等,2010;Wawrzkiewicz等,1987)。 酶学性质研究的结果表明,该酶类的分子质量为18~240kDa,大多数是为30 kDa左右,最适温度范围为30~80℃,多数在40~60℃,最适pH 7.5~10,少数偏微酸性,如须毛癣菌角蛋白酶 (Tsuboi等,1989)。如上所述,王秋影等(待发表)研究表明,淡紫拟青霉PL-HN-16角蛋白粗酶的最适作用温度为40℃,最佳作用pH为8.0,是一个比较温和的碱性角蛋白降解酶。
角蛋白酶作用底物除角蛋白外,还包括多种多肽和其他蛋白质,如:胶原蛋白、酪蛋白、弹性蛋白、血红蛋白、明胶和卵蛋白等(Jaouadi等,2010;Wang等,2008)。也有一些角蛋白酶的底物范围很窄,如密旋链霉菌(Streptomyces pactum)所产的角蛋白酶,对底物表现出高度的立体选择性和二级结构专一性,能快速分解鸟类羽毛,但较难利用其他天然角蛋白(Bo·ckle等,1995)。角蛋白酶活性受到多种因素的影响,多数角蛋白酶的活性表达依赖低浓度二价金属离子Ca2+、Mg2+等的存在,而一些金属离子 (Hg2+、A13+等)则抑制其活性(Jaouadi等,2010;Cai等,2008)。 丝氨酸角蛋白酶酶活可被苯甲基磺酰氟(PMSF)所抑制,金属角蛋白酶酶活可被EDTA等所抑制(Jaouadi等,2010;Thys等,2004)。来源不同的角蛋白酶具有不同的专一性抑制剂,这或许暗示着角蛋白酶的进化起源不同(李江等,2006)。
由于角蛋白、明胶和胶原等结构纤维蛋白具有紧密的空间结构,限制了蛋白酶与其潜在的裂解位点靠近与结合,其只能被很少的蛋白酶所降解。Kim等 (2004)研究报道了角蛋白酶Fervidolysin酶原的晶体结构,发现该酶原为1.7A0的晶体结构,由4个结构域组成,即1个催化结构域(CD)、2 个 β-折叠结构域(SDs)以及 1 个肽键结构域(PD),Fervidolysin酶原与降解一般蛋白底物的subtilisin E酶原PD~SD亚结构亲缘关系较远;与人类降解纤维聚合体底物—明胶的metalloprotease-2酶原的空间结构类似,暗示着 Fervidolysin酶原与 metalloprotease-2酶原的纤连蛋白样结构域有着功能相关性。这表明,角蛋白酶与降解不溶性底物的蛋白酶可能具有更相似的空间结构特性。多结构域蛋白Fervidolysin酶原的晶体结构为解释酶原激活以及非催化结构域的作用提供了新视野。
3.1 角蛋白酶编码基因 目前,虽然筛选到了大量的角蛋白酶产生菌,但克隆到的角蛋白酶基因却相对较少。部分角蛋白酶基因见表2,其中以源自地衣芽胞杆菌的KerA研究得最为透彻。
表2 微生物角蛋白酶编码基因
3.2 角蛋白酶的表达 在角蛋白酶的表达研究中,对KerA基因研究得最多,涉及大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母3类表达系统。Lin等(1997)将KerA基因转入蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株 DB104 中,转化子 FDB-3、FDB-108和FDB-29可以在含羽毛的LB培养基中分泌角蛋白酶,而原始菌株在LB培养基中无角蛋白酶活性。转化子FDB-29的角蛋白酶产量是原始菌株的3.5倍,推测是因在其启动子Pker上结合了营养型启动子P43而增强KerA基因的表达所致。Porres等(2002)把KerA基因和编码前肽的1.2 kb DNA片段克隆后转化至巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)X33中表达,转化子 pPICZa-A-kerA在甲醇诱导后可产生重组酶,144 h后产量为124 mg/L。重组的角蛋白酶为糖基化酶,与天然地衣芽孢杆菌角蛋白酶的性质相似。
角蛋白酶的基因工程研究已日渐开展 (表3),但仍存在表达蛋白以包涵体形式存在,不利于蛋白活性的研究;异源蛋白的表达对宿主菌产生毒性,限制宿主菌的生长;在表达量积累过程中,碱性蛋白酶会造成自身降解;单位表达量低,高效表达较困难等诸多问题,难以在生产实践中应用(李明珠等,2010)。
多数产角蛋白酶微生物发酵起始pH为6~9,发酵温度为28~50℃,少数嗜热微生物发酵温度控制在70℃左右,如热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)和闪烁杆菌属(Fervidobacterium sp.)等(蔡成岗,2007)。 在培养基组成方面,羽毛、羽毛粉、羊毛、角、毛发等角蛋白为碳和氮源时可以诱导角蛋白酶的产生,其他碳源和氮源类物质对角蛋白酶的发酵具有一定的影响。Wang和Shih(1999)对原始地衣芽孢杆菌PWD-1和重组枯草芽孢杆菌FDB-29的最佳发酵过程进行了探讨。结果表明,两者产生的角蛋白酶均可由蛋白类物质诱导,而被糖类物质抑制。发酵过程中6~10 h的种龄对于PWD-1后续发酵产酶很关键,而FDB-29对种龄不敏感。培养过程中发酵液pH由7.0上升到8.5。PWD-1生长最适温度为50℃,两菌株产酶最适温度均为37℃,最佳溶氧水平分别为10%和20%。当在50℃培养PWD-1菌体8 h后,转移到37℃发酵使酶产量提高了10倍。在发酵条件分别优化后,PWD-1比FDB-29菌株的终产酶水平高40%。Harde等(2011)采用单因子法、L8正交表设计试验和响应面分析法,探讨了碳源、氮源和pH对角蛋白酶产量的影响,研究认为,羽毛、氯化铵、磷酸氢二钾以及硫酸锰是显著因子,最终优化后的培养基使角蛋白酶的最大产量提高到12.32 kU/mL。Ni等(2011)研究发现,羽毛浓度为20 g/L,发酵起始pH为8.0时,地衣芽孢杆菌ZJUEL31410角蛋白酶产生效果最理想,酶活达54.9 U/mL,羽毛降解率为72.4%,氨盐和硝酸盐可强烈抑制角蛋白酶的产量和羽毛的降解。
表3 微生物角蛋白酶基因的表达
角蛋白的降解是一个非常复杂的过程。由于不同微生物所产生的角蛋白酶性质不同,其降解角蛋白的机制也不尽相同。由最初的高级结构降解为次级结构到角蛋白分子的完全溶解存在着明显的差异,这一过程如何由微生物或角蛋白酶主导并完成至今还未完全阐明。目前普遍认为,微生物降解角蛋白的过程可分为变性作用、水解作用和转氨基作用三个步骤。
黄林等(2006)提出,角蛋白酶是一种复合酶,其中含有特异裂解二硫键的二硫键还原酶和使多肽水解的多肽水解酶。其降解过程为:首先,二硫键还原酶作用于角蛋白二硫键,将胱氨酸 (-SS-)还原为半胱氨酸(-SH),使角蛋白高级结构解体而形成变性角蛋白,变性角蛋白在多肽水解酶作用下逐渐水解成多肽、寡肽和游离氨基酸,最后由转氨基作用产生氨气和硫化物而使角蛋白彻底水解。在角蛋白降解过程中,角蛋白中的硫主要转化成巯基化合物、硫化氢(H2S)和硫酸盐三种含硫化合物存在于分解产物中。
有研究表明,淡紫拟青霉PL-HN-16在以鹅毛为氮源的培养过程中,培养液会出现胨化现象,培养至第3天时,培养液开始变稠呈胨状,鹅毛几乎全部消失,发酵液呈乳白色,会附着在瓶壁上,随着发酵时间的延长,发酵液会越来越黏稠,胨化更加显著,继续培养1周后,发酵液会再次逐步液化,整个过程约需20 d。研究认为,这可能是由于淡紫拟青霉角蛋白酶为复合酶,具有二硫键还原酶活性,能首先打开底物的二硫键,使角蛋白的高级结构被破坏,将角蛋白解聚变成单体并进一步将其变为纤丝;尽管培养液中的蛋白总浓度不变,但角蛋白解聚后,培养液中的丝蛋白浓度变大,导致培养液出现胨状物;而后在复合蛋白酶的作用下,将丝蛋白进一步水解为多肽、寡肽和游离氨基酸,这样就会增加其溶解度,最终呈现液化状态。但由于角蛋白的降解机制非常复杂,淡紫拟青霉角蛋白酶作用机理尚待进一步研究(王秋影等,待发表)。
综上所述,角蛋白的微生物降解与利用备受关注。然而,目前对角蛋白酶的认识还不够深入。国外一些学者的研究工作,已涉及角蛋白酶高级结构、活性表达分子基础以及酶工程等分子生物学研究。而国内对角蛋白酶的研究还停留在角蛋白酶产生菌的分离、筛选,角蛋白酶的分离纯化与理化性质的研究,以及角蛋白酶的作用机制的初步阶段,研究的对象也极其有限,且以胞外酶的研究为主,对胞内酶的研究甚少。已报道的角蛋白酶表达菌株的产量及酶活相对天然菌株并不是完全具有明显的优势,与工业生产的要求还存在一定距离,因而在菌种筛选、基因改造和载体选择方面还需进一步研究,以提高角蛋白酶的产量和活性,使其更好的应用于工业生产。
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