植物组织培养中常见问题与对策

祁建国

摘要：从植物组织培养中常见的污染、褐化、玻璃化现象等问题入手，分析了其形成的原因，并结合自身工作经验提出针对性的解决策略，对植物的组织快繁和工厂化育苗具有一定的参考意义和借鉴价值。

关键词：组织培养；污染；褐化；黄化

1 污染问题及对策

1.1 污染原因分析

控制污染是组培过程中的首要技术。造成污染的原因很多，如外植体的种类、取材的季节、时间、预处理方法、消毒药剂的种类、浓度、消毒时间以及消毒方法、培养基和器皿灭菌、操作人员、工作环境的要求、超净工作台的工作质量等都与污染密切相关。一般来说，组培污染源分为3大类：材料带菌、接种污染、培养过程感染。

1.2 对策

选择合理的外植体种类、取材的季节、时间、初代接种选取大小适宜的外植体。在组培中应选取带菌较少或不带菌体的材料作为外植体。对母株预处理，改善植株栽培环境，对母株喷布杀菌剂或抗生素。改变灭菌方法，使用真空减压灭菌、多次消毒灭菌、混合消毒液、灼烧等。在培养基中加入其它抑菌剂。切分潜在的带菌材料时，要保证所用的接种工具已经过彻底的消毒；继代培养时确保污染的材料应给予丢弃。针对接种污染，要做到紫外灯接种室消毒，清洗超净工作台；接种工具、材料不要与酒精灯、超净工作台铁网面、台面接触；接种人员接种时用酒精棉擦手或用浓度为75 %的酒精喷洒双手，接种时应穿上无菌的白大衣，戴上帽子和口罩；无菌室要注重平时除湿和熏蒸消毒工作。培养过程中要定期对培养室进行消毒处理，及时清除污染材料，污染的材料及仪器必须经过药液消毒后方可使用。

2 褐化问题及控制措施

2.1 褐化概念及原因分析

褐化是指在植物组织培养过程中，外植体在诱导脱分化或再分化时，自身组织由其表面向培养基释放褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐化一般分为2种：由于细胞受胁迫或其它不利条件影响所造成的细胞死亡而形成的褐化现象；由于酚类物质被多酚氧化酶氧化所引起的褐化。影响褐化的因素一般与基因型、外植体情况、培养条件、培养基有关。如温度对褐化影响很大，高温能使 多酚氧化酶的活性提高，促进酚类氧化；而低温可以抑制酚类化合物的合成，降低多酚氧化酶活性，减少酚类氧化，从而减轻褐化。

2.2 控制措施

多选择幼龄植株取材，使外植体处于旺盛的生长状态，可大大减轻褐变。在植株的一定部位取材，使材料中酚类物质含量较低，也有助于减少褐化。对母株进行遮光处理，不仅利于初代培养物的萌发，还可减轻褐化程度。利用硫代硫酸钠、植酸、抗坏血酸等抗氧化剂、活性炭等吸附剂能够阻止多酚氧化物对酚类物质的氧化作用，可减少或减轻褐变。实验证明，琼脂量的减少、较低的pH值也有利于减少褐变。选取适宜的培养条件如适度的低温、初培暗光或弱光培养可抑制酚类的氧化，采用45℃以上的短时间高温处理也能使多酚氧化酶失去活性，达到抗褐变的目的。

3 玻璃化现象及解决途径

3.1“玻璃化现象”内涵及发生原因

玻璃化现象是指在培养过程中材料呈半透明状，组织结构发育畸形的现象。玻璃化的苗因组织畸形，分化能力降低，移栽后也很难成活，所以不宜用作继代和移栽的材料。它已成为组培工作的一大难题，目前其根本原因尚无定论。根据吴若菁等[1]对香石竹的组培研究得知，影响组培苗玻璃化的原因主要与激素的种类、浓度、琼脂的浓度、外植体的取材部位、不适宜的培养条件有关。

3.2 解决途径

可从以下几个方面降低或防止玻璃化现象的发生。①利用固体培养，调节培养基的 pH值，提高琼脂浓度，降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏，可降低玻璃化；②适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，提高培养基的碳氮比，降低 NH4+浓度，降低培养基中的渗透势，减少培养基中植物材料可获得的水分；③降低培养器内部环境的相对湿度，保持适宜温度，改善氧气供应状况，减少玻璃化苗的出现；④适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度；⑤利用高于40℃的温度对外植体热击处理可消除玻璃化；⑥增加自然光照，实验证明，玻璃苗放于自然光下几天后，茎、叶变红，玻璃化现象可逐渐消失，这可能与自然光中的紫外线有关；⑦改善培养容器的通风换气条件，如用通气好的封口膜封口。

4其它问题及相关对策

如黄化现象和变异率高的问题。培养基中 Fe含量不足、培养环境通气不良、培养温度不适、激素配比不当、糖用量不足、光照不足等都会造成黄化现象。只有找出问题的根源对症下药才能从根本上解决问题。关于变异率高的问题，不仅不利于保存资源和培育优良的品种，还会严重影响工业化生产的组培苗的质量，必须从原始材料、培养基配方、增殖代数、愈伤组织等方面严控变异率的发生。

参考文献

1 吴若菁,尤华明,彭东辉. 香石竹组培苗玻璃化控制的研究[J].福建林学院学报,1995（4）

(责任编辑王蔓)