液相色谱法测定槟榔饮片中槟榔碱含量的不确定度评定*

赵振东，周雪晴，刘艳凤，冯玉红

(海南大学材料与化工学院，海口 570228)

液相色谱法测定槟榔饮片中槟榔碱含量的不确定度评定*

赵振东，周雪晴，刘艳凤，冯玉红

(海南大学材料与化工学院，海口 570228)

根据《测量不确定度评定与表示》对液相色谱法测定槟榔饮片中槟榔碱含量的不确定度进行评定。通过分析得出，体积类不确定度是主要影响因素。分析结果表明，当槟榔饮片中槟榔碱含量为0.58%时，其扩展不确定度为0.02%（k=2）。

液相色谱法；槟榔；槟榔碱；不确定度

槟榔是棕榈科植物槟榔(Areca Catechu L.)的成熟种子，其性味温辛、无毒，有杀虫、破积、下气、行水等多种功效，对虫积、食滞、泻痢严重、水肿及脚气等症均有较好的治疗效果。槟榔中含生物碱0.3%～0.6%，其中槟榔碱为主要有效成分［1］。

笔者根据国家质量技术监督局发布的JJF1059–1999计量技术规范《测量不确定度评定与表示》，并参照其它文献，首次对液相色谱法测定槟榔中槟榔碱含量的测量不确定度进行了分析，考察了其不确定度的主要来源，为实验过程的控制和检测报告的评估提供了科学的依据［2］。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Waters 2695型，美国waters公司，经华南国家计量测试中心检定为合格计量器具；

电子天平：AUW220D（0.1/0.01 mg），日本岛津公司，经海南省计量测试所检定为①级合格；

单标线容量瓶：10 mL，经海南省计量测试所检定为A级；

可调移液器：100μL，经海南省计量测试所检定；

超纯水制备系统：PURELAB ULTRA ANALYTIC型，美国ELGA公司；

氢溴酸槟榔碱：纯度100%，美国Sigma公司；

乙二胺、磷酸：分析纯；

甲醇、乙醇：色谱纯，美国Fisher公司；

超纯水：电阻率为18.2 MΩ·cm。

1.2 实验方法

（1）对照品溶液的制备

精密称取氢溴酸槟榔碱对照品10.01 mg(mR)于10 mL(VR1)量瓶中，加水溶解并定容至刻度，作为对照品储备液。用可调移液器量取对照品储备液0.1 mL(VR2)于10 mL(VR3)量瓶中，加水定容至刻度，此溶液作为槟榔碱对照品溶液。

（2）供试品溶液的制备

精密称取槟榔粗粉50.000 4 g（m）于1 L三角瓶中，加氨水8 mL，加乙醚800 mL超声15 min，倾出乙醚提取液至预置8 mL磷酸液的蒸发皿中，再分别加乙醚640，320 mL，超声2次，每次15 min，合并乙醚提取液，挥去乙醚，残渣加50%甲醇溶解，转移至10 mL(VS)容量瓶，并以同一溶剂稀释至刻度，摇匀，离心（10 000 r/min）10 min，上清液经液相色谱测定［3］。

1.3 色谱条件

色谱柱：C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；紫外检测波长：215 nm；流动相：0.3%乙二胺溶液(磷酸调pH 7.5)–甲醇–乙腈（体积比为1∶3∶1），流速为1.0 mL/min［4］。

1.4 测定和计算

将对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，并计算槟榔碱含量。对照品溶液分别进样3次，平均峰面积AR为334 976；供试品溶液分别进样3次，平均峰面积AS为390 301；按照建立的数学模型计算，槟榔饮片中槟榔碱含量为0.58%。

1.5 数学模型和不确定度计算公式

样品中槟榔碱含量测定采用外标法，槟榔饮片中槟榔碱含量按式（1）计算：

式中：w——槟榔饮片中槟榔碱含量，%；

mR——氢溴酸槟榔碱对照品质量，mg；

VS——供试品溶液的定容体积，mL；

VR2——稀释时可调移液器量取的对照品储备液的体积，mL；

AS——供试品溶液中槟榔碱的峰面积，μV·s；

P——对照品的纯度，为100%；

m——槟榔粗粉质量，mg；

VR1——对照品储备液的定容体积，mL；

VR3——对照品溶液的定容体积，mL；

AR——对照品溶液中槟榔碱的峰面积，μV·s。

则槟榔饮片中槟榔碱含量的相对标准不确定度按式（2）计算：

1.6 不确定度来源

根据以上数学模型和不确定度计算公式，可以得出含量测定结果(w)的不确定度分量分别来源于mR，m，VS，VR1，VR2，VR3，AS，AR和P。对这9个不确定度来源，按其性质可以分为质量类不确定度(mR，m)、体积类不确定度(VS，VR1，VR2，VR3)、峰面积类不确定度(AS，AR)以及对照品纯度类不确定度。

2 不确定度评定［5，6］

2.1 对照品纯度引入的不确定度

氢溴酸槟榔碱购自美国Sigma公司，纯度100%，分散区间半峰宽a =0.05%(P=100 %)，按矩形分布计算，对照品纯度引入的不确定度为：

相对标准不确定度为：

2.2 体积类不确定度（VS，VR1，VR2，VR3）

2.2.1 供试品溶液的定容体积(VS)引入的不确定度

（1）10 mL单标线容量瓶体积校准引入的不确定度

单标线容量瓶体积的校准不确定度来源于校准时有限的准确度。单标线容量瓶(10 mL)A级品的法定允差为±0.02 mL，考虑到中心区的分布几率大于极值附近，按照三角形分布进行计算，不确定度为0.02 mL/60.5=0.008 2 mL。

（2）温度引入的不确定度

该项不确定度来源于校准温度不同时引入的体积差别。实验室的温度在19～25℃之间，最大温差为6℃，水溶液的体积膨胀系数约为2.1×10–4/℃，玻璃的体积膨胀系数约为1.5×10–5/℃，忽略玻璃的体积膨胀系数，按照矩形分布计算，10 mL单标线容量瓶的不确定度为：

（3）单标线容量瓶体积重复性引入的不确定度

该不确定度来源于连续核查排出的满刻度体积液体的标准偏差，为A类不确定度，通常用称量法确定。对一单标线容量瓶（10 mL）A级品的重复性进行评估，称得液体质量分别为9.901，9.905，9.902，9.903，9.905，9.902，9.897，9.901，9.912，9.909 g，按照Bessel公式，计算得到体积重复性不确定度为0.001 4 mL。

则供试品溶液的定容体积(VS1)引入的不确定度为：

相对标准不确定度为：

2.2.2 对照品储备液的定容体积(VR1)引入的不确定度

由于用单标线容量瓶(10 mL)A级品定容，因此计算原理及结果同“2.2.1”部分，即：

2.2.3 稀释时可调移液器量取对照品储备液的体积(VR2)引入的不确定度

计算原理同“2.2.1”部分。

(1)可调移液器量取体积校准引入的不确定度

移液器(0.1 mL)法定允差为±0.002 mL，按照三角形分布进行计算，不确定度为:

(2)温度引入的不确定度

按照矩形分布计算，移液器(0.1 mL)的不确定度为：

(3)可调移液器体积重复性引入的不确定度

对移液器(1 mL)的重复性进行评估，称得液体重量（g）分别为0.100 4，0.100 7，0.101 1，0.100 5，0.100 7，0.100 5，0.100 3，0.101 4，0.100 6，0.1050 7，按照Bessel公式，计算得到体积重复性不确定度为0.000 007 mL。

合成以上不确定度，对照品储备液的体积(VR2)引入的不确定度为：

则相对标准不确定度为：

2.2.4 对照品溶液的定容体积(VR3)不确定度

由于用单标线容量瓶(10 mL)A级品定容，计算原理及结果同“2.2.1”部分，即:

2.3 质量类不确定度（mR，m）

2.3.1 氢溴酸槟榔碱对照品质量（mR）引入的不确定度

（1）天平校准引入的不确定度

使用的电子天平(d=0.01 mg)为一级工作天平，检定证书给出最大允差为±0.15 mg，按照三角形分布进行计算，不确定度为：

（2）称量重复性引入的不确定度

该项不确定度来源于同一物体称量时读数的标准偏差，为A类不确定度。对氢溴酸槟榔碱重复称量10次，读数分别为10.05，10.06，10.10，10.08，10.05，10.10 ，10.11，10.07，10.04，10.07 mg，根据Bessel公式计算得到质量重复性引入的不确定度为0.007 6 mg。

2.3.2 槟榔粗粉质量（m）引入的不确定度

（1）天平校准引入的不确定度

使用天平同“2.3.1”部分，不确定度为：

(2)称量重复性引入的不确定度

来源于同一物体称量时读数的标准偏差，为A类不确定度。对槟榔粗粉重复称量10次，读数分别为50.001 5，50.001 7，50.001 2，50.001 7，50.001 1，50.001 1，50.001 6，50.001 1，50.001 3，50.001 1 g，根据Bessel公式计算得到重量重复性不确定度为0.082 mg。

2.4 峰面积类不确定度（AS，AR）

2.4.1 峰而积(AS)重复性引入的不确定度

该不确定度来源于重复进样时峰面积的标准偏差,为A类不确定度。在本实验中，重复进样3次，峰面积为390 322，390 260，390 321，平均峰面积为390 301。按照Bessel公式，则相对标准不确定度为：

2.4.2 峰而积(AR)重复性引入的不确定度

来源于重复进样时峰面积的标准偏差为A类不确定度。在本实验中，重复进样3次，峰面积为334 983，334 965，334 979。平均峰面积为334 976。按照Bessel公式，则相对标准不确定度为：

3 合成不确定度

将以上数据代入式（2），得到槟榔饮片中槟榔碱含量的相对标准不确定度为：

则标准不确定度为：

4 扩展不确定度与测定结果表示

槟榔含量测定结果的扩展不确定度U=ku(w)，取k=2，则U=2×0.007%≈0.02%。槟榔饮片中槟榔碱含量可表示为0.58%±0.02%，k=2。

5 结语

对槟榔饮片中槟榔碱的液相色谱法测定结果的不确定度进行了评定。评定结果表明，体积类不确定度是主要的不确定来源；质量类不确定度和对照品纯度类不确定度对实验结果影响不大；而峰面积类不确定度则几乎可以忽略不计。因此，涉及溶液配制过程是本实验中影响测定结果的主要因素，需重点加以控制。

［1］ 赵振东，谢艳丽，牛成，等.毛细管电泳法分析槟榔中槟榔碱和槟榔次碱［J］.海南师范学院学报,2009，22(2): 170–172.

［2］ 中国实验室国家认可委.化学分析中不确定度的评估指南［M］.北京，中国计量出版社，2002.

［3］ 史载锋，吴亚弟，林小明，等.槟榔碱提取分离工艺的研究［J］.海南师范学院学报，2006，19 (3): 246–247.

［4］ 冯玉红，陈国良，于文辉，等.现代仪器分析实用教程［M］.北京：北京大学出版社，2008: 89–112.

［5］ 金鹏飞，邹定，姜文清.格列吡嗪片高效液相法含量测定结果的不确定度评定［J］.药物分析杂志，2008，28(7): 1 136–1 140.

［6］ 张霞，许永，刘巍，等.离子色谱法测定卷烟主流烟气中氨含量的不确定度评定［J］.化学分析计量，2011，20(4): 16–19.

Uncertainty Evaluation for Determining Content of Arecoline in Areca by HPLC

Zhao Zhendong， Zhou Xueqing， Liu Yanfeng， Feng Yuhong
(College of Materials and Chemical Engineering， Hainan University， Haikou 570228， China)

The measurement uncertainty of Arecoline in Areca by HPLC was evaluated according to Evaluation and Presentation of Uncertainty in Measurement. Volume uncertainty was main factor. The Expanded uncertainty was 0.02%(k=2)，as the content of Arecoline in Areca was 0.58%.

HPLC; Areca; Arecoline; uncertainty

O657.7+2

A

1008–6145(2012)03–0007–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.002

* 海南大学材料与化工学院青年基金项目(南药槟榔的开发与利用)

联系人：冯玉红；Email: zhaozhd@gmail.com

2012–02–08