凝胶渗透净化–超高效液相色谱–串联质谱法测定橙汁中链格孢霉毒素*

李建华，何强，孔祥虹，乐爱山，吴双民

（陕西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，西安 710068）

凝胶渗透净化–超高效液相色谱–串联质谱法测定橙汁中链格孢霉毒素*

李建华，何强，孔祥虹，乐爱山，吴双民

（陕西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，西安 710068）

建立橙汁中4种链格孢霉毒素含量测定的凝胶渗透–超高效液相色谱–串联质谱检测方法。样品用乙腈提取后，用填料为Bio-Beads-S–X3的凝胶渗透色谱柱净化，净化时流动相采用乙酸乙酯–环己烷（体积比为1∶1），流速为5 mL/min，测定时用超高效液相反相C18色谱柱分离，甲醇–水系统梯度洗脱，采用电喷雾负离子源和多反应监测（MRM）模式定性和定量。4种链格孢霉毒素的最低定量限在0.000 4～0.002 mg/kg范围内，加标回收率为78.9%～111.5%，测定结果的相对标准偏差均低于9.0%(n=10)。

凝胶渗透；橙汁；链格孢霉毒素；超高效液相–串联质谱

链格孢霉毒素是一类毒性较大的真菌毒素，而且分布广泛［1］。Rodrigo等从患褐斑病的橙皮中检出链格孢酚（AOH）及链格孢酚甲醚（AME）［2］，而橙汁是人们喜爱的饮料之一，如果在橙汁生产过程中原料果选材不严格、采用带皮压榨的生产工艺，就有可能在橙汁中引入链格孢霉毒素，危害人们的饮食健康。Stefan等采用稳定同位素稀释–液相色谱–串联质谱法曾经从橙汁中检出AOH和AME［3］，但Rodrigo和Stefan等人仅检测了两种毒素。本研究同时测定橙汁样品中链格孢酚（AOH）、链格孢酚甲醚（AME）、链格孢霉素（ALT）和腾毒素（Tentoxin）4种常见毒素。

文献报道，链格孢霉毒素检测时样品净化方法有固相萃取法［4–7］、QuEChERS法［8］，而采用凝胶渗透色谱（GPC）净化的方法尚未见有相关的文献报道。笔者利用凝胶渗透色谱对橙汁样品中的4种链格孢霉毒素进行净化，取得了良好的效果。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：AcquityTM型，配Quattro Premier XE串联质谱仪、电喷雾电离（ESI）接口，美国Waters公司；

全自动凝胶渗透净化系统：ULTRA型，德国LCTech公司；

甲醇：HPLC级，德国MERCK公司；

乙酸乙酯、环己烷：分析纯，天津科密欧化学试剂公司；

氯化钠：分析纯，天津市津北精细化工有限公司；

无水硫酸钠：分析纯，使用前于650℃灼烧4 h，天津市津北精细化工有限公司；

链格孢霉素、链格孢酚、链格孢酚甲醚标准品：纯度均大于99.0 %，美国Sigma公司；

腾毒素标准品：纯度大于99.5 %，英国Apolloscienti fi c公司；

超纯水：由美国Millipore公司Milli-Q超纯水净化系统制备。

1.2 仪器测定条件

（1）色谱条件

色谱柱：ACQUITY BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司)；柱温：35℃；流动相采用甲醇–水梯度洗脱，在0～3 min内甲醇由35%线性递增至90%，保持0.5 min，然后在0.2 min内恢复至35%，并保持2 min，整个过程流动相中水的比例相应递减或递增；流速：0.3 mL/min；进样量：5.0 μL。

（2）质谱条件

采用电喷雾离子源负离子扫描、多反应监测（MRM）模式检测；链格孢霉素定量离子对为m/z 291.1/247.1，定性离子对为m/z 291.1/229.0；链格孢酚定量离子对为m/z 257.1/213.1，定性离子对为m/z 257.1/146.9；腾毒素定量离子对为m/z 413.4/141.0，定性离子对为m/z 413.4/271.3；链格孢酚甲醚定量离子对为m/z 271.1/256.1定性离子对为m/z 271.1/228.1；离子源温度：115℃；脱溶剂温度：400℃；脱溶剂气流量：600 L/h；锥孔气流量：50 L/h；碰撞室氩气流量：0.2 mL/min。

1.3 标准溶液配制

准确称取适量的链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚标准品，分别用乙腈配制成100 μg/mL的标准储备液，再利用标准储备液配制混合标准液，使用时根据需要用乙腈–水（体积比为1∶1）逐级稀释混合标准液，配制成适当浓度的标准工作溶液。

1.4 样品处理

称取10 g（精确至0.01 g）橙汁于50 mL离心管中，加入4 g氯化钠，10 mL乙腈，振荡提取10 min，以3 000 r/min离心5 min，将上层乙腈提取液转移到浓缩瓶中。再分别用10 mL乙腈重复提取两次，合并乙腈提取液，于40℃水浴中减压浓缩至近干，氮气吹干，用10.0 mL乙酸乙酯–环己烷（体积比为1∶1）溶解残渣，过滤。取5.0 mL滤液用凝胶渗透色谱净化，凝胶渗透色谱净化条件：内径25 mm，柱长400 mm，填料为Bio-Beads-S–X3 Beads（38～75 μm）的凝胶柱，流动相为乙酸乙酯–环己烷（体积比为1∶1），流速5.0 mL/min，收集19.0～30.0 min的流出液，40℃减压蒸至近干，氮气吹干，用2.00 mL甲醇–水（体积比为1∶1）溶解定容，过0.2 μm滤膜，供液相色谱–串联质谱测定和确证。

2 结果与讨论

2.1 凝胶渗透净化条件的考察

凝胶渗透色谱利用分子筛的原理对化合物进行分离净化具有独特的净化效果，在食品安全检测领域应用广泛［9］。在检测橙汁中链格孢霉毒素时，如果样品净化不好，在质谱测定时会产生基质效应，影响定性和定量的准确性。由于橙汁中含有一定的脂肪和色素，特别是采用带皮压榨工艺时橙皮中的橙皮油会带人橙汁中，影响测定，所以通过实验考察，选择去除脂肪和色素效果良好的凝胶渗透色谱进行样品净化。在凝胶渗透色谱净化时，链格孢霉素在19.5～25.5 min收集完全；链格孢酚在19～27 min收集完全；腾毒素在20～27 min收集完全；链格孢酚甲醚在22～30 min收集完全。为保证4种毒素的回收率，最终确定收集时间为19.0～30.0 min，橙汁样品净化良好，基本消除了样品测定时的基质效应。

在凝胶渗透色谱净化时，一般认为化合物的流出顺序与相对分子质量相关，相对分子质量越大流出越快［9］，但本实验中腾毒素的相对分子质量最大（m/z 414.5），链格孢酚相对分子质量最小（m/z 258.2），4种毒素的流出顺序与相对分子质量大小并不一一对应，这可能与化合物的空间结构及分子扩散性质有关，腾毒素相对分子质量虽大，但由于结构紧凑，分子空间体积与其它3种毒素无大的差异（4种毒素的化学结构式参见文献［10］），体积大小均在凝胶颗粒的渗透极限［11］内，所以流出顺序无显著差异，而由于4种化合物的扩散特性不同，会造成收集的时间宽度不同。

2.2 液相色谱条件的优化

由于ESI模式需要较低的流动相流速，而在低流速下普通液相色谱柱的峰形不佳，所以实验选用适用于低流速下样品分离的超高效液相色谱柱，而超高效液相色谱柱目前的粒径主要有1.7，1.8 μm两种，长度主要有50，100 mm两种，由于4种链格孢霉毒素在50 mm色谱柱上已能获得较好的分离，所以最终选用BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）进行样品检测。

选择流动相时，在保证4种链格孢霉毒素均能获得较好的色谱分离及较好的峰形前提下，选用简便、价格低廉的甲醇–水系统，实验中主要对梯度条件进行了考察。由于链格孢霉素（ALT）的极性相对较大，流动相中需要较高比例的水才能获得好的色谱保留，而链格孢酚甲醚（AME）的极性相对较小，流动相中需要较高比例的甲醇才能改变色谱峰形，所以为了兼顾不同极性的4种链格孢霉毒素，流动相需要有较大的梯度变化。实验中通过不断调整，兼顾不同化合物的保留时间、灵敏度、稳定性等指标，确定了1.2中的液相色谱流动相梯度条件。在1.2条件下4种链格孢霉毒素标准溶液的多反应监测离子流图如图1所示。

图1 4种链格孢霉毒素标准溶液的多反应监测离子流图

2.3 线性方程与检出限

配制浓度为0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 mg/L的4种链格孢霉毒素混合系列标准溶液，按1.2的液相色谱–串联质谱条件进样检测，并以标准浓度（X，mg/L）为横坐标，定量离子对峰面积（Y）为纵坐标作图，用最小二乘法进行线性回归，4种毒素的线性相关系数（r）均大于0.996，线性关系均良好。链格孢霉素、链格孢酚、腾毒素、链格孢酚甲醚的线性方程分别为Y=71 466X+92.35，Y=43 221X+601.56，Y=178 392X+3 431.6，Y=509 255X–1 061.5。

将标准溶液稀释进样，按3倍信噪比（S/N=3）计算检出限，4种毒素的检出限在0.000 6～0.003 mg/L范围内。按10倍信噪比（S/N=6）计算定量限，4种毒素的定量限在0.002～0.01 mg/L范围内，根据样品前处理方法换算，本方法4种毒素的最低定量限在0.000 4～0.002 mg/kg范围内。

2.4 回收率与精密度

加标回收试验取空白橙汁样品，每个样品添加0.01，0.02，0.04 mg/kg 3个水平的4种混合毒素，每个添加水平重复测定10次。回收率及精密度数据如表1所示，加标回收率均在78.9%～111.5%范围内，相对标准偏差均低于9%。

表1 回收率及精密度测定结果（n =10）

2.5 样品测定

利用该方法检测7批橙汁样品，其中1批中检出链格孢酚为0.003 3 mg/kg、链格孢酚甲醚为0.001 8 mg/kg，另外6批样品中4种毒素均未检出。

3 结语

采用超高效液相色谱–串联质谱法测定橙汁中链格孢霉毒素的含量，首次采用凝胶渗透色谱技术净化橙汁样品中链格孢酚、链格孢酚甲醚、链格孢霉素和腾毒素等4种常见链格孢霉毒素，并取得良好的净化效果，基本消除了样品检测时的基质效应，保证了检测结果的准确可靠。

参 考 文 献

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［5］ Fente C A，Jaimez J，Vázquez B I，et al. Determination of alternariol in tomato paste using solid phase extraction and highperformance liquid chromatography with fl uorescence detection［J］. Analyst，1998，123: 2 277–2 280.

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［8］ Rasmussen R R，Storm I M L D，Rasmussen P H，et al. Multimycotoxin analysis of maize silage by LC–MS/MS［J］. Anal Bioanal Chem，2010，397: 765–776.

［9］ 周相娟，李伟，徐华，等.凝胶渗透色谱技术及其在食品安全检测方面的应用［J］.现代仪器，2009(1): 1–4.

［10］ Michael S，Rudolf K，Rainer S. A liquid chromatography/tandem mass spectrometric multi-mycotoxin method for the quanti fi cation of 87 analytes and its application to semi-quantitative screening of moldy food samples［J］. Anal bioanal chem，2007，389: 1 505–1 523.

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Determination of Alternaria Toxins Residues in Orange Juice by UPLC–MS–MS Coupled with Gel Permeation Chromatography Puri fi cation

Li Jianhua， He Qiang， Kong Xianghong， Yue Aishan， Wu Shuangmin
(Technical Center， Shaanxi Entry –Exit Inspection and Quarantine Bureau， Xi’an 710068， China)

A new method using gel permeation chromatography(GPC) clean up followed by ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry (UPLC–MS–MS) was developed for the determination of 4 alternaria toxins in orange juice. Samples were extracted with acetonitrile，then purified by Bio-Beads-S–X3 GPC column with ethylacetate–cyclohexane(volume ratio was 1∶1) as the mobile phase at a fl ow rate of 5 mL/min. The chromatographic analysis was performed on an UPLC reversed-phase C18column using methanol-water as a gradient solvent system. The qualitative and quantitative analysis were performed with negative ions electrospray ionization source and multiple reaction monitoring(MRM) mode. The quantitation limits of the four alternaria toxins were between 0.000 4 mg/kg and 0.002 mg/kg. The recoveries ranged from 78.9% to 111.5% with relative standard deviations less than 9.0%(n=10).

gel permeation chromatography; orange juice; alternaria toxin; UPLC–MS–MS

O657.7+2

A

1008–6145(2012)03–0020–04

10.3969/j.issn.1008–6145.2012.03.006

*国家质检公益性科研项目（200810618）；陕西省农业科技攻关项目（2010k01–19–4）

联系人：何强；E-mail: qianghe12@163.com

2012–02–09