破格救心汤对心衰大鼠血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa浓度的影响

李焕彬，陈法桂，陈 嘉

（1.广州中医药大学第三临床医学院，广东 广州 510405；2.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405；3.广州中医药大学实验动物中心，广东 广州 510405）

现代临床上应用破格救心汤治疗慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）疗效确切，但其作用机制尚未明确。研究表明，CHF引起血栓形成或血栓栓塞是导致患者死亡的主要原因之一[1]。血小板聚集是血栓形成的关键环节，而血小板膜糖蛋ⅡbⅢa（GP－ⅡbⅢa）与纤维蛋白原等黏附蛋白结合，是多种因素引起血小板活化的最终共同通路，与血栓性疾病特别是缺血性心、脑血管疾病的发生发展密切相关，从而成为血小板活化的标志物之一[2]。因此，GP－ⅡbⅢa浓度升高可能明显增加CHF患者的死亡率。本试验研究了破格救心汤对CHF大鼠GP－ⅡbⅢa浓度的影响，旨在探讨其治疗CHF的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性8周龄清洁级SD大鼠36只，体重180g～200g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号：4405900082。

1.1.2 药物 破格救心汤[3]：附子150g、干姜60 g、炙甘草60g、山萸肉120g、生龙骨粉30g、生牡蛎粉30g、活磁石粉30g、高丽参30g（另煎）、麝香0.5g（冲），加水2000mL文火煮取400mL。药物购自广州采芝林药业。

1.1.3 主要试剂 盐酸阿霉素，CUSABIO BIOTE CH CO.，LTD，Lot：702012；注射用水，四川科伦药业股份有限公司，批号M11031617；大鼠血小板膜糖蛋白ⅡbⅢa ELISA试剂，CUSABIO BIOTE CH CO.，LTD，Lot：W09073328。

1.1.4 主要设备 心电图机，型号CARDIMAX FX－2111，北京福田电子医疗仪器有限公司；酶标仪，DG5033A型，南京华东电子集团医疗装备有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的制备 采用李玉玲等[4]建立的阿霉素诱导心衰大鼠模型造模法，将注射用的盐酸阿霉素，用注射用水配制成2mg／mL溶液，按4mg／kg体重，即2mL／kg腹腔注射SD大鼠，每周1次，共6周，累积总量24mg／kg体重。6周后检测心电图肢体Ⅱ导联ST段抬高伴T波高尖即为造模成功[5]。

1.2.2 试验分组与给药 36只大鼠自由饮水进食，饲养于18℃～25℃明暗各12h的清洁级动物实验室内，喂养1周后，随机分为3组。空白组：造模时按2mL／kg体重腹腔注射注射用水，每周1次，共6周，累积总量24mg／kg体重，造模6周后，每天2次灌胃饮用水10mL／kg；模型组：造模6周后，每天2次灌胃饮用水10mL／kg；破格救心汤组：造模6周后，每天2次灌胃破格救心汤10mL／kg。每组给药连续6周。

1.2.3 指标检测 采用ELISA试剂盒进行GP－ⅡbⅢa浓度的测定。

1.2.4 GP－ⅡbⅢa样品及其标准品的制备 制备GP－ⅡbⅢa样品：在试验开始后第6周末将全部动物经眼眶静脉采血，全血样本于室温放置2h后于3000r／min离心10min，取上层澄清液作为GP－ⅡbⅢa样品。制备GP－ⅡbⅢa标准品：取2份GP－ⅡbⅢa样品以样品稀释液稀释至1mL，盖好后静置15min后，反复颠倒、搓动以助溶解，其浓度为400ng／mL，分别稀释至200，100，50，25，12.5，6.25 ng／mL，样品稀释液直接作为标准浓度0ng／mL。

1.2.5 GP－ⅡbⅢa样品及其标准品的加样与显色酶标板设空白孔、标准孔、待测样品孔，分别对应加样品稀释液、标准品和待测样品各100μL，轻轻晃动混匀，酶标板盖上覆膜，37℃反应120min；弃去液体，甩干后每孔加新配制的生物素化抗GP－ⅡbⅢa抗体工作液100μL，37℃温育60min；弃去液体，甩干后洗板3次；甩干后每孔加HRP标记的亲和素工作液100μL，操作步骤同抗GP－ⅡbⅢa抗体工作液；甩干后每孔加TMB溶液90μL，37℃避光显色约25min，立即每孔加1mol／L H2SO4终止液50μL终止反应，此时蓝色立转黄色。

1.2.6 GP－ⅡbⅢa浓度的检测 在加终止液后立即用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。本试验均设双孔测定，以保证检测结果的准确性。

1.2.7 GP－ⅡbⅢa浓度计算方法 根据一系列标准品的浓度以及相对应的OD 450nm通过CurveExpert1.3软件分析得到其二次方程式为：y＝8.7402469＋9.729678x＋50.013467x2（其中x为OD 450nm值，y为GP－ⅡbⅢa标准品的浓度）。将样品的OD 450nm值代入方程式，计算出样品浓度。

1.2.8 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行统计学处理。数据结果以“¯x±SD”表示，2组间比较用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠死亡情况和一般情况观察

模型组死亡4只，破格救心汤组和空白组无死亡。模型组大鼠造模后出现鼻唇紫绀、四肢末梢苍白、被毛粗糙变黄、腹部脱毛、反应迟钝、进食减少、行动缓慢等心衰症状。与模型组比较，破格救心汤组大鼠心衰症状明显减轻，毛色白而具有光泽，反应灵敏，进食增多，活动度加强。

2.2 各组大鼠GP－ⅡbⅢa浓度结果分析

与空白组比较，模型组大鼠GP－ⅡbⅢa浓度显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，破格救心汤组心衰大鼠GP－ⅡbⅢa浓度显著降低（P＜0.01）；与空白组比较，破格救心汤组大鼠GP－ⅡbⅢa浓度稍高，但差异不显著（P＞0.05）（表1）。

3 讨论

CHF属于中医的心悸、怔忡、咳喘、水肿、胸痹、积聚、虚劳等病证的范畴，阳气亏虚、血瘀水停为其主要病机，益气温阳、活血利水为其有效治法[6]。破格救心汤经40年临床验证，其治疗CHF疗效确切。组方中附子回阳救逆；干姜和附子则“甘与辛合而生阳”，又牵制附子之毒；炙甘草既有扶正作用又能制附子之毒；山茱萸助附子固守已复之阳，挽五脏气血之脱失，加强了此方扶正固脱，活血化淤的力量；高丽参大补元气，滋阴和阳；龙骨、牡蛎固肾摄精，收敛元气；磁石镇惊安神，纳气平喘；麝香开窍醒神，活血散结。诸药相配，可助元阳固，阴阳和，开中有补。该方注重整体，增强了仲景四逆汤类方的回阳救逆功效，这对进一步稳定生命体征、救治心衰等起到了重要作用[7]。

表1 各组大鼠GP－ⅡbⅢa浓度Table1 The GP－IIbIIIa concentrations in the rats of each group

研究表明，CHF患者血栓栓塞性疾病的发生率明显升高，增加了CHF患者的死亡率。血栓形成和血栓栓塞的发生与血小板活化聚集密切相关。血小板聚集由血小板GP－ⅡbⅢa受体所调节，激活的GP－ⅡbⅢa受体主要结合纤维蛋白原，纤维蛋白原分子在相邻的血小板之间形成横桥，构成血小板骨架，这是血小板聚集的关键[8]。因此，GP－ⅡbⅢa浓度是血小板活化程度的重要标志，检测GP－ⅡbⅢa浓度的变化可以判断冠脉缺血患者体内血小板活化情况。同时，GP－ⅡbⅢa受体颉颃剂运用于抗血小板治疗有确切疗效[9－10]。由此可见，在心力衰竭的治疗中，降低GP－ⅡbⅢa浓度，减少血栓栓塞性疾病的发生率，从而降低CHF患者的死亡率，可能是新的治疗途径。

试验结果显示，心衰大鼠用破格救心汤灌胃治疗后心衰症状明显减轻，且未出现死亡，说明其治疗心衰大鼠有效。采用酶联免疫分析法，分析了其对心衰大鼠GP－ⅡbⅢa浓度的影响。结果显示，模型组大鼠GP－ⅡbⅢa浓度较空白组显著升高，表明破格救心汤能明显降低心衰大鼠GP－ⅡbⅢa浓度至接近空白组水平。说明造模后心衰大鼠血小板明显活化，发生其凝集作用；予以破格救心汤治疗后，大鼠血小板凝集作用明显受到抑制。说明破格救心汤治疗心衰大鼠的作用机制可能与其对GP－ⅡbⅢa浓度的影响有关。

综上所述，破格救心汤能降低心衰大鼠GP－ⅡbⅢa浓度，减少血栓栓塞性疾病的发生率，这可能是其治疗CHF的作用机制之一。

[1]李志斌，买买提·阿不都热依木.慢性心力衰竭与血栓栓塞的研究现状[J].心血管康复医学杂志，2010，19（1）：110－112.

[2]王振华，薛 梅，殷惠军，等.血小板膜GP－ⅡbⅢa活性与缺血性心脑血管疾病[J].中国临床康复，2006，48（10）：142－144.

[3]李 可.李可老中医急危重症疑难病经验专辑 [M].2版.山西太原：山西科学技术出版社，2004：1－17.

[4]李玉玲，杨建业，唐俊明，等.阿霉素诱导大鼠心衰模型不同方案的比较[J].中国比较医学杂志，2006，16（2）：93－96.

[5]梁逸强，陈远平.破格救心汤对心力衰竭大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].现代中西医结合杂志，2006，15（6）：716－717.

[6]翟卷平，郭秋红，王 卓，等.葶苈生脉方对心衰大鼠心肌细胞凋亡的影响[J].河北中医药学报，2010，25（3）：5－6.

[7]吴锦波，曾 勇.破格救心汤救治过敏性休克合并急性心力衰竭1例[J].浙江中西医结合杂志，2010，20（2）：106－107.

[8]阮长耿.血小板与血栓性疾病[J].医学研究通讯，2004，33（7）：7－10.

[9]李迎雪，孙 强，靖博彬，等.新型血小板GPⅡb／Ⅲa受体拮抗剂Z4A5抗血小板作用的研究[J].中国药理学通报，2012，28（2）：227－230.

[10]李仲培.血小板GPⅡb／Ⅲa受体拮抗剂临床应用观察[J].现代医院，2010，10（2）：42－43.