鸭黄病毒的分离鉴定

陈仕龙，陈少莺＊，王 劭，李兆龙，程晓霞，林锋强，朱小丽，江 斌，黄梅清，郑 敏，毛 宁

（1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州 350013；2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013）

2010年9月，福建省长乐某蛋鸭养殖场出现一种产蛋鸭发热、产蛋显著下降、采食减少、后备小鸭头颈歪斜、软脚为主要特征的疾病。剖检主要表现为脑壳出血、卵泡出血、萎缩，部分卵黄破裂，形成卵黄性腹膜炎。为明确病因，福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物病毒研究室（以下称本实验室）在该场发病鸭病料中分离到一株病毒，经分离毒的部分理化特性分析、动物回归、RT－PCR等测定，证实分离毒是导致该场疾病的病原，属于黄病毒科黄病毒属的鸭黄病毒。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集及处理 病料来源于2010年福建省长乐某蛋鸭养殖场。无菌采集减蛋蛋鸭的肝、脾、胰腺、卵泡、输卵管、卵巢等组织，经接种鲜血琼脂平板后，剪碎研磨，以Hank＇s液制成1∶5匀浆，加双抗各1000单位，4℃过夜，冻融3次，6000r／min离心20min，取上清液为病毒分离的病料。

1.1.2 病毒、血清及禽胚 鸡黄病毒分离株CJD05由本实验室分离、鉴定、保存。鸡抗鸡黄病毒阳性血清，由本实验室制备保存。11日龄番鸭胚购自福州山区健康番鸭场；SPF鸡胚购自福州大北农生物技术有限公司，并孵化至9日龄。

1.2 方法

1.2.1 病毒分离 取病料处理物经尿囊腔接种11日龄番鸭胚和9日龄SPF鸡胚各4枚，0.1mL／枚，37℃孵育，每日观察2次至第7天，弃去24h内的死胚，死亡胚胎置4℃冰箱4h以上，剖检、观察病变，收获胚胎和胚液，在－70℃冻存或传代。

1.2.2 分离毒的血凝特性 按文献[1]进行，在37℃、pH7.2的PBS中测定尿囊液分离毒对鸡、鸽红细胞的血凝性。

1.2.3 分离毒的毒价及中和试验 参照文献[2]，取第4代番鸭胚尿囊液病毒液用Hanks液作10倍系列稀释，每一稀释度各接种4枚11日龄番鸭胚，37℃ 孵育，观察7d，按 Reed－Muench 法计算ELD50。取等体积的200ELD50病毒液与一系列倍比稀释的鸡抗鸡黄病毒阳性血清充分混合，37℃作用1h后接种9日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种4枚，0.1mL／枚，37℃ 孵育7d，弃去24h内的死胚，统计鸡胚死亡情况，按Reed－Muench法计算中和效价。

1.2.4 分离毒的RT－PCR鉴定 根据本研究室以禽黄病毒3＇端基因通用引物建立的RT－PCR检测方法（内部资料，待发表），提取分离毒尿囊液及鸡黄病毒分离株CJD05的核酸，进行RT－PCR检测，扩增目的片段大小为708bp。

1.2.5 分离毒的人工感染试验 对产蛋高峰的蛋鸭口服、肌注、点眼等方式感染番鸭胚第4代尿囊液病毒，1.0mL／羽，共10羽；同时设对照组，每羽注射灭菌Hanks液，1.0mL／羽，共10羽。隔离试验，每天观察采食、饮水及产蛋等性能，连续观察数天，并在试验结束时攻毒组和对照组各取4羽剖杀，观察剖检病变并采集病料进行病毒分离和RT－PCR鉴定。

2 结果

2.1 细菌分离

取典型发病鸭的血、肝、脾、输卵管等组织接种鲜血琼脂平板培养7d，均未分离到细菌。

2.2 病毒分离

病料接种番鸭胚和SPF鸡胚尿囊腔，均能致死鸡胚和番鸭胚，于接种后72h～120h死亡，在胚肝中有出血、坏死病变，尿囊液清亮，分离毒命名为DJD09。

2.3 分离毒血凝性测定

第1～3代尿囊液分离毒在37℃、pH7.2条件下不能凝集鸽子、鸡的红细胞，说明分离毒不是副黏病毒、禽流感病毒或减蛋综合症病毒。

2.4 分离毒的毒价及中和特性

第4代番鸭胚尿囊液分离毒在番鸭胚中的ELD50为104.0／0.1mL。分离毒能被鸡黄病毒阳性血清所特异中和，中和效价为1∶64，证实分离毒类似鸡黄病毒。

2.5 RT－PCR 鉴定

分别以鸡黄病毒CJD05及分离毒DJD09核酸作为模板，进行RT－PCR扩增，均能扩增出与预计大小相符的片段，进一步证实分离毒为禽黄病毒中的鸭黄病毒（图1）。

图1 RT－PCR扩增的电泳图Fig.1 The results of RT－PCR detection

2.6 人工感染试验

取分离毒DJD09人工感染产蛋高峰的蛋鸭，能复制出与自然病例一致的临床症状和剖检病变，表现为攻毒后第4天开始产蛋、采食逐渐减少；直到攻毒后12d，产蛋停止，食欲废绝。随机处死4只，见卵泡充血、出血、萎缩和变形；其中2羽卵泡破裂，形成卵黄性腹膜炎，输卵管壁出血，人工感染组产蛋率明显低于对照组，并能从攻毒鸭内脏中重新分离到病毒，且禽黄病毒RT－PCR检测为阳性。

3 讨论

鸭黄病毒病是流行于我国的一种新型黄病毒病，最早出现于1995年的河北省石家庄、邯郸等地，温立斌等[3]首次鉴定该病的病原为黄病毒科的鸭病毒性脑炎病毒，国外未见报道。2010年，该病在我国多个省、市大面积流行，给我国养鸭业，特别是蛋鸭养殖业造成了巨大的经济损失。该病主要以多品种鸭脚麻痹、头颈歪斜等运动机能失调的神经症状，产蛋鸭产蛋急降、出血性卵巢炎为特征[3－8]。临床上非常容易与禽流感、新城疫等疾病相混淆，确诊必须依靠实验室诊断 。

本研究从临床表现为产蛋下降和神经症状为特征的发病鸭中分离到一株病毒，病毒无血凝性，能致死鸡胚及番鸭胚，能被鸡黄病毒阳性血清特异中和；RT－PCR检测中，分离毒核酸能被禽黄病毒引物所特异扩增；病毒回归能导致与临床相类似的症状；表明分离毒为近年来危害我国养鸭业的鸭黄病毒。鸭黄病毒病病原的明确，为该病的深入研究提供了基础。

鸭黄病毒属于黄病毒科、黄病毒属、蚊传播病毒的恩塔亚病毒群，和该群中的Tembusu病毒亲缘关系最近[4，8]。本研究组分离到的鸡源黄病毒（导致蛋鸡产蛋急降）、鸭源黄病毒与国内其他学者公布的鸭黄病毒分离株基因高度同源[9]，鸡黄病毒阳性血清能够中和鸭黄病毒分离株。黄欣梅等[10]报道，从鸭、鹅产蛋率、采食量下降中分离的鹅黄病毒也与Tembusu病毒基因序列有很高的同源性。推测近年来流行于我国的鸡、鸭、鹅黄病毒病很可能是同一种病毒，他们之间有着相同的起源及进化。鉴于不同学者对该病的命名不同，应该尽早规范该病的命名，在业内统一该病的名称。

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