萱草花茎离体培养与快速繁殖

毕晓颖 王 宁

(沈阳农业大学，沈阳，110161)

萱草(Hemerocallis spp.)是百合科萱草属的多年生草本花卉，其花型优美、花色丰富、叶丛美观，适应广泛的土壤和气候条件，是世界上最重要的宿根花卉之一，具有很高的经济价值和广阔的应用前景［1－2］。近年来，随着生态节约型园林理念的倡导，宿根花卉越来越受重视，人们对萱草新品种的需求也越来越大。但目前国内应用的萱草品种大多引自国外［3－4］，价格昂贵，种源有限，且种苗生产以传统分株繁殖为主，繁殖系数低，因此，很难在短时间内获得大量优质种苗，严重地限制了其在园林中的广泛应用。

离体再生培养是植物大规模微体繁殖和遗传转化研究的技术保障［5－6］。目前已报道了萱草通过花茎［7－10］、叶片［11］、原生质体［12］等途径再生完整植株，但研究主要集中在‘金娃娃’等少数品种上，而且不同品种的结果不尽相同［13－15］。基因型是影响植物再生体系建立的关键因素之一。萱草遗传背景复杂，品种资源丰富，截止2009年，仅在美国萱草协会登录的品种就达64 329个。因此，不同品种间基因型的差异可能是影响萱草植株再生的首要因素。培养基中激素种类及质量浓度也是影响植株再生的重要因素之一。本研究以17个优良萱草品种为试材，建立萱草花茎离体再生体系，探讨基因型及激素对萱草花茎离体再生植株的影响，为不同基因型萱草再生体系的建立和试管苗的工厂化生产奠定基础。

1 材料与方法

试验于2009年6月—2011年6月份在沈阳农业大学园艺学院组织培养室进行。供试17个萱草品种分别为‘金娃娃’(‘Stella De Oro’)、‘波旁之王’(‘Bourbon King’)、‘小酒杯’(‘Little Wine Cup’)、‘摩洛哥红’(‘Marocco Red’)、‘波久’(‘Pojo’)、‘秋红’(‘Autumn Red’)、‘杜 威’(‘Dewey Roquemore’)、‘走好运’(‘Bonanza’)、‘重瓣魏河’(‘Double River Wye’)、‘紫泉’(‘Purple Waters’)、‘层雪’(‘Ortic Snow’)、‘小野蜂’(‘Little Bumble Bee’)、‘盛夏红酒’(‘Summer Wine’)、‘海尔范’(‘Frans Hals’)、‘喜归来’(‘Happy Returns’)、‘娃娃 语’(‘Siloam Baby Talk’)、橙花’(‘Orange’)，试材均取自沈阳农业大学花卉基地，选用幼嫩花茎为外植体。

材料用流水冲洗20 min，然后在超净工作台内用70%酒精浸泡30 s，再用0.1%HgCl2浸泡8 min，然后用无菌水冲洗3～5次，置于三角瓶中备用。

初代培养:将‘金娃娃’萱草花茎外植体接种到附加不同质量浓度的6－BA、NAA、IBA的培养基上，每个处理9瓶，每瓶3个外植体，重复3次。用于筛选诱导愈伤组织及不定芽分化的最佳培养基。在 MS+6 －BA1.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1培养基上，接种花茎分枝处以上部分和分枝处以下部分，每个部位接种5瓶，每瓶3个外植体，重复3次，比较花茎不同部位离体培养再生效果。

将不同基因型萱草花茎分枝处以上部分接种在MS+6 － BA1.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1培养基上，每个处理接种5瓶，每瓶2个外植体，重复3次。4周时统计愈伤组织诱导率和不定芽分化率。愈伤组织诱导率=(形成愈伤组织外植体数/接种外植体数)×100%，不定芽分化率=(分化不定芽外植体数/形成愈伤组织外植体数)×100%。

继代增殖培养:将金娃娃初代培养的芽丛转移到附加不同质量浓度的6－BA、NAA、IBA的培养基上，每个处理接种9瓶，重复3次。用于筛选继代增殖培养最适合的培养基。

在 MS+6 －BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1培养基上分别接种不同基因型初代培养的芽丛，每个处理接种9瓶，重复3次。继代培养30 d后统计丛生芽的增殖系数。增殖系数=不定芽增殖总数/接种不定芽数。

生根培养:将生长健壮，高5 cm左右的试管苗转接到1/2MS附加不同质量浓度NAA和IBA的生根培养基上，每个处理接种5瓶，每瓶3个外植体，重复3次。15 d后调查生根率、生根条数及根长度。生根率=(生根的无根苗个数/接种的无根苗总个数)×100%。

炼苗移栽:当试管苗根长1.5 cm左右时，将三角瓶封口膜逐渐打开，炼苗3 d后移栽到河沙中。20 d后调查移栽成活率。成活率=(成活苗数/移栽总苗数)×100%。

培养条件:以MS为基本培养基，附加3.0%蔗糖、5.0 g·L－1琼脂，pH=5.8，培养温度(25 ±2)℃，光照强度20 ～30 μmol·m－2·s－1，光照时间 12 h·d－1。

应用DPS7.05统计软件中完全随机设计单因素统计邓肯氏新复极差显著性分析处理数据。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对花茎愈伤组织诱导及不定芽分化的影响

接种数天后，外植体均有不同程度膨大和翻卷，15 d后开始有愈伤组织产生并逐渐分化出不定芽。附加IBA的培养基诱导出的愈伤组织浓绿色、致密，附加NAA的培养基诱导出的愈伤组织黄白色、疏松。由表1可知，NAA比IBA更有利于愈伤组织的诱导和分化，当6－BA的质量浓度为1.0 mg·L－1，NAA 的质量浓度为 0.05 mg·L－1或 0.10 mg·L－1时，愈伤组织诱导率和不定芽的分化率最高，分别为 67.9%和 80.0%、70.4% 和 84.2%，差异不显著，但NAA的质量浓度为0.10 mg·L－1时分化出的不定芽数量更多，质量更好(图1A)。因此，初代培养最适合的培养基为 MS+6－BA1.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1。

表1 不同培养基对‘金娃娃’萱草花茎外植体愈伤组织诱导及不定芽分化的影响

2.2 花茎不同部位对愈伤组织诱导及不定芽分化的影响

由表2可知，花茎不同部位外植体的愈伤组织诱导率和不定芽分化率差异显著，花茎分枝处以上部分的愈伤组织诱导率和不定芽分化率分别为84.4%和92.1%，分枝处以下部分仅为37.8%和64.4%。由此可见，花茎分枝处以上部分是愈伤组织诱导及不定芽分化的最佳外植体部位。研究中还发现，花茎分枝处以上部分除了切口处产生愈伤组织外(图1B)，分枝处也能产生愈伤组织并分化出不定芽(图1C)。

表2 ‘金娃娃’萱草花茎不同部位对愈伤组织诱导及不定芽分化的影响

2.3 不同基因型花茎愈伤组织诱导及不定芽分化的差异

在 MS+6 －BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1培养基上，16个萱草品种的花茎外植体接种10～15 d后均可以产生愈伤组织，但不同品种的愈伤组织诱导率差异显著，愈伤组织的颜色、质地和生长速度也有所不同。如表3所示，‘秋红’、‘波旁之王’和‘海尔范’的愈伤组织诱导率均在50%以上;‘重瓣魏河’和‘娃娃语’的愈伤组织诱导率最低，仅为6.7%。外植体接种20～30 d，愈伤组织不断膨大，表面形成突起并且陆续分化出不定芽，其中‘波旁之王’、‘波久’、‘秋红’、‘海尔范’的不定芽分化率均在80%以上;‘杜威’和‘盛夏红酒’不定芽的分化率最低，只有16.7%和25.0%。不同基因型的不定芽质量和数量差别比较大，‘波旁之王’和‘小酒杯’每块愈伤组织分化的不定芽数均在10株以上(图1D、图1E)，‘摩洛哥红’每块愈伤组织仅可以分化出2～3株不定芽(图1F)。试验发现，‘波旁之王’、‘波久’、‘秋红’、‘海尔范’等品种80%以上的愈伤组织是在花梗分枝处产生的，并且很容易分化出不定芽。

图1 萱草离体培养快速繁殖过程

表3 不同基因型萱草花茎外植体愈伤组织诱导及不定芽分化的差异

2.4 不同培养基对试管苗增殖的影响

由表4可知，不同培养基的试管苗增殖系数差异显著，添加NAA的培养基显著高于添加IBA的培养基。其中，MS+6 －BA2.0 mg·L－1+NAA0.10 mg·L－1培养基的增殖系数最高，为 5.5，但在添加NAA的培养基上，芽苗主要通过愈伤组织分化出不定芽的方式增殖，这类不定芽的整齐度和成活率较低，特别是多次继代培养后，诱导出的乳白色愈伤组织结构松散，虽然能保持一定的分化率，但是成苗率逐渐降低。而在添加IBA的培养基上，芽丛的基部可以直接形成不定芽，这类不定芽健壮、整齐、生长迅速，其中MS+6－BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1的增殖系数为 4.7(图1G)。综合考虑，继代增殖最适合的培养基为MS+6 － BA2.0 mg·L－1+IBA1.0 mg·L－1。

表4 不同培养基对‘金娃娃’萱草试管苗增殖的影响

2.5 不同基因型萱草试管苗增殖的差异

由表5可知，不同品种的试管苗增殖系数差异显著，试管苗的生长状况也有差异，‘海尔范’的增殖系数最高，为5.2，试管苗叶色浅绿，长势较好(图1H);‘秋红’的试管苗叶色浓绿，植株健壮;‘紫泉’的增殖系数虽然较高，但是部分植株呈现玻璃化;‘波久’增殖系数最低，为1.5，大部分植株叶片卷曲，长势较差(图1G)。

表5 不同基因型萱草试管苗增殖的差异

2.6 不同激素种类及质量浓度对试管苗生根的影响

萱草生根较为容易，但在不同培养基中的生根率、根数及根长度差异显著。在附加IBA的培养基中，试管苗生根迅速，根黄白色、细长柔软，不易折断，组培苗较高且健壮;由表6可知，IBA质量浓度为3.0 mg·L－1时，试管苗生根率最高，为 93.3%，平均生根条数4.2条(图1J)。在附加NAA的培养基中，试管苗基部有愈伤组织，生根缓慢，根白色，粗且脆，NAA质量浓度为0.10 mg·L－1时，生根率最高，为82.2%，平均根数为3.0条。因此，最适合的生根培养基为 1/2MS+IBA3.0 mg·L－1。

2.7 炼苗与移栽

使用河沙作为基质，试管苗移栽5 d后叶片变浓绿，移栽10 d后根系明显伸长，并长出大量的侧根，植株生长健壮(图1K)，移栽成活率达98%以上。待小苗发新叶即可上盆移栽(图1L)。

表6 不同激素种类及质量浓度对萱草试管苗生根的影响

3 结论与讨论

很多萱草组织培养研究都采用花茎为外植体［16－18］，与茎尖或根等为外植体相比，花茎用作初代培养的外植体具有取材方便、材料丰富、易消毒、不损伤母本植株、能保存母本品种优良性状、不定芽诱导率高等优点。但萱草为圆锥花序，花茎较长且存在分枝，具体是哪部分起作用不甚明了。文中的研究结果表明，其中起关键作用的是幼嫩花茎分枝以上部分，这与兰丽婷［7］、倪新［19］和 Chen Jianxin［20］的研究结果一致，这样在外植体的选择上就更有准确性。

本研究发现，‘金娃娃’花茎外植体在不同激素种类及质量浓度配比的培养基上愈伤组织诱导率和不定芽分化率差异显著，说明激素是影响萱草花茎离体再生的重要因素。将17个萱草品种的花茎分枝处以上部分作为外植体，接种在相同的培养基上，其愈伤组织诱导和不定芽分化能力表现出显著差异，其中‘金娃娃’最高，其次是‘波旁之王’、‘秋红’和‘海尔范’，‘重瓣魏河’和‘娃娃语’最低。可见，基因型也是影响萱草离体再生的重要因素之一，这与倪新［19］和宋雪莲等［21］的研究结果相同。因此，今后应针对不同萱草品种进行系统的组织培养研究。

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