高效液相色谱法同时测定盆炎净片中原儿茶酸、咖啡酸和芍药苷含量

黎 强 ，张晓娟 ，罗 玲

盆炎净片由忍冬藤、狗脊、蒲公英、益母草、车前草、川芎、赤芍、鸡血藤8味中药组方，具有清热利湿、利血通络、调经止带功效[1]。方中忍冬藤清热解毒，疏风通络;鸡血藤主要补血，活血通络;狗脊补肝肾，强腰膝;益母草活血调经，利尿消肿;川芎活血行气，祛风止痛;赤芍清热凉血，散瘀止痛。原标准仅选取忍冬藤及赤勺作为定性指标，赤勺中芍药苷作为定量指标。有学者增加鸡血藤、益母草、川芎的鉴别作为定性指标，增加忍冬藤中绿原酸的含量测定，提高了盆炎净片的质量控制要求[2]。为更全面地控制药品质量，本试验中拟用高效液相色谱(HPLC)法同时测定盆炎净片中原儿茶酸、咖啡酸、芍药苷的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100型Series高效液相色谱仪(四元泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱);TU－1221型紫外可见分光光度计(北京普析通用);AE240型电子分析天平(梅特勒－托利多);SB2200型超声清洗器(上海必能信超声有限公司)。乙腈、磷酸(色谱纯)，纯净水(杭州娃哈哈集团);原儿茶酸对照品(批号为809－200102)，咖啡酸对照品(批号为110885－200102)，芍药苷对照品(批号为110736－200934，含量95.7%)，均购于中国药品生物制品检定所，供含量测定用;盆炎净片(陕西白鹿制药股份有限公司);忍冬藤、鸡血藤、蒲公英、狗脊、川芎、益母草、车前草、赤勺等8味药材均为市售品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Agilent Eclipse XDB－C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相:乙腈－0.1%磷酸梯度洗脱，0～10 min时乙腈 8%和0.1%磷酸 92%，10～25 min时乙腈 14%和 0.1%磷酸 86%;流速:0.8 mL/min;检测波长:219 nm;进样量:10 μL。在此条件下，3个组分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，理论板数按原儿茶酸、咖啡酸、芍药苷计均大于5 000(图1)。

2.2 溶液制备

取盆炎净片10片，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入15 mL甲醇，称定质量，超声处理20 min，放冷，用甲醇补足质量，摇匀，过滤，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密称取原儿茶酸、咖啡酸和芍药苷对照品适量，以甲醇为溶剂分别制成质量浓度为 1.4，1.4，0.6 g/L 的贮备液，并制备含原儿茶酸28μg/mL、咖啡酸28μg/mL和芍药苷120μg/mL的混合对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验:按处方制备分别不含鸡血藤、蒲公英及赤勺原药材的样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液，依法进样。结果分别在原儿茶酸、咖啡酸和芍药苷的对应峰位上未出现色谱峰，说明阴性对照品溶液对测定无干扰(见图1)。

线性关系考察:分别精密吸取对照品贮备液，采用等量递减方法制得系列质量浓度的混合对照品溶液，进样分析，记录色谱峰面积，以对照品质量浓度(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标绘制标准曲线。结果见表1。

精密度试验:将同一混合对照品溶液在上述色谱条件下重复进样5次。结果原儿茶酸、咖啡酸和芍药苷峰面积的 RSD分别为0.7% ，0.4%，0.5%。

图1 高效液相色谱图

表1 线性关系考察结果

稳定性试验:取同一供试品溶液，分别在 0，2，4，8，12 h时按上述色谱条件进行测定。结果原儿茶酸、咖啡酸和芍药苷峰面积的 RSD分别为0.8%，1.8%，1.0%，表明供试品溶液至少在12 h内稳定。

重复性试验:取同一批样品(批号为100306)，依法平行制备6份供试品溶液并进样分析。结果原儿茶酸、咖啡酸和芍药苷含量平均值为 1.605 9，1.556 9，3.655 2 mg/g，RSD 分别为 1.2%，1.4% ，1.0%。

加样回收试验:分别取已知含量的样品(批号为100306)6份，每份约0.25 g，精密称定，分别精密加入对照品贮备液，挥干溶剂后按供试品溶液制备方法制备溶液并测定各成分的含量，计算回收率。结果见表2。

表2 原儿茶酸、咖啡酸、芍药苷加样回收试验结果(n=6)

2.4 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液并进样测定，以外标法计算含量。结果见表3。

表3 样品含量测定结果(mg/g)

3 讨论

将适当质量浓度的原儿茶酸、咖啡酸和芍药苷对照品溶液在200～400 nm波长范围内进行吸收光谱扫描，结果原儿茶酸在259 nm和219 nm波长处有最大吸收，咖啡酸在323 nm和219 nm波长处有最大吸收，芍药苷在229 nm波长处有最大吸收，经综合考量，最后确定测定波长为219 nm。

因本试验中成分靠近末端吸收，在色谱条件筛选试验中，比较乙腈－水、乙腈－1%磷酸、乙腈－0.1%磷酸溶液3个流动相后，确定乙腈－0.1%磷酸为最终条件。当进样量为20μL时，样品过载，峰形严重前沿，而调整进样量为10μL后，则样品峰形尖锐，对称性良好。

考察使用溶剂时，曾采用甲醇、50%甲醇、乙醇对样品进行提取，结果甲醇的提取效率最高;后通过超声15，20，30 min，回流1，1.5 h，振荡等提取方法比较，得出用甲醇超声提取20 min时提取效果最好，基线相对较平[5－6]。

含量测定中，不同批号样品间咖啡酸含量差别较大。而咖啡酸会与奎尼酸反应生成绿原酸[7]，是否因此原因导致咖啡酸含量不稳定，仍需要进一步验证。

[1]YBZ25272005，国家食品药品监督管理局标准(试行)[S].

[2]杨遁嘉，霍 昕，刘文炜，等.鸡血藤颗粒质量标准的研究[J].中成药，2009，3(1):144 －146.

[3]尹 伟，岳春华，雷 伟，等.盆炎净片的质量控制[J].中南药学，2007，5(3):246 － 149.

[4]钱正明，李会军，李 萍.高效液相色谱法测定忍冬藤和叶中8种活性成分[J].分析化学，2007，8(35):1 159 －1 163.

[5]邓君丽，王兆霞.HPLC测定消炎片中咖啡酸的含量[J].中成药，2007，29(4):615 －616.

[6]耿家玲，盂 芹.HPLC法测定灯盏细辛中绿原酸和咖啡酸的含量[J].中国药师，2010，13(5):701 －702.

[7]孟 伟，温亚男，魏永巨，等.金银花中绿原酸含量的荧光法测定[J].分析化学，2009，37(A01):211.