恶性胶质瘤细胞死亡诱导信号复合体表达与TRAIL诱导凋亡的关系

于洪泉，张 宇，金 宏，赵东海，杨淑艳，齐 玲

（1.吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021；2.吉林医药学院病理学教研室，吉林 吉林 132013）

恶性胶质瘤细胞死亡诱导信号复合体表达与TRAIL诱导凋亡的关系

于洪泉1，张 宇1，金 宏2，赵东海2，杨淑艳2，齐 玲2

（1.吉林大学第一医院神经外科，吉林 长春 130021；2.吉林医药学院病理学教研室，吉林 吉林 132013）

目的：通过研究恶性胶质瘤细胞中死亡诱导信号复合体（DISC）与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）诱导凋亡的关系，初步探讨TRAIL诱导凋亡抵抗的机制。方法：分离恶性胶质瘤组织，获得和培养原代胶质瘤细胞，用100μg·L－1TRAIL作用后采用酸性磷酸酶法检测细胞凋亡水平；Western blotting法检测细胞表达死亡诱导信号复合体的水平。结果：获得3株（GC417、GC321、GC125）原代恶性胶质瘤细胞；3株细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感程度不同［GC321（0.12±0.01vs0.51±0.02）和GC125（0.22±0.01vs0.36±0.01）］，对TRAIL诱导凋亡作用敏感，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；而GC417（0.24±0.01vs0.23±0.02）对TRAIL诱导凋亡不敏感。Western blotting法检测结果显示，死亡诱导信号复合体表达不同，GC321和GC125表达增高，GC417表达减少。结论：不同来源的原代培养恶性胶质瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的反应不同，死亡诱导信号复合体表达也不同，死亡诱导信号复合体表达的减少可能与凋亡抵抗的发生密切相关。

胶质瘤；死亡诱导信号复合体；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；细胞凋亡

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis－inducing ligand，TRAIL）作用于细胞后，主要是通过形成死亡诱导信 号 复 合 体 （death－inducing signaling complex，DISC），使caspase－8活化，使肿瘤细胞发生凋亡［1］。所以，DISC中任一成分对TRAIL凋亡信号的传导都很重要，发生错误时会导致TRAIL凋亡通路阻断。国内外相关研究［2－3］表明：DISC在TRAIL凋亡传导通路中占有非常重要的地位，因此，本文作者在此基础上进一步研究DISC在原代培养的胶质瘤细胞中的作用，为TRAIL作为肿瘤治疗新药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养［4］取新鲜人脑胶质瘤组织（吉林大学第一医院提供，病理诊断为Ⅲ－Ⅳ级脑胶质瘤）。冷PBS冲洗后将组织剪成小块（1mm×1mm×1mm），置于离心管中，加入胰酶消化，37℃孵育30min，离心弃上清，培养液重悬细胞，计数活细胞，加入10%DMEM／F12培养液（Gibco公司），以1×106／75cm2细胞密度接种后将培养瓶置入37℃、5%CO2孵箱、于饱和湿度下进行培养，隔日换液，1∶3传代，获得3株原代培养的GC417、GC321及GC125恶性胶质瘤细胞。

1.2 酸性磷酸酶法检测细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性 待细胞融合至85%，0.25%胰酶消化，计数活细胞，以每孔8×103个细胞接种于96孔板中，培养24h，将细胞分为4组，每组设5个复孔，加入TRAIL（100μg·L－1），对照组使用基础培养基。作用24h，小心弃上清，PBS洗去培养基，每孔加入酸性磷酸酶底物检测液（对硝基苯新鲜配制）100μL，继续培养90min，加入终止液，室温下孵育5min。酶标仪405nm处测定各孔吸光度（A）值。

1.3 Western blotting法检测细胞中DISC成分细胞培养3d，待细胞生长90% 左右，弃去培养液，加入0.01mol·L－1PBS充分洗涤细胞，弃去PBS，0.25%胰酶消化，将细胞收集于1.5mL离心管中，3 000r·min－1离心5min，弃上清。PBS充分洗涤细胞，离心后弃上清，每个样品加入50μL的细胞裂解液，细胞充分裂解后，12 000g、4℃离心15min，上清移于另一管中，弃去沉淀，Braford测定法检测样品蛋白浓度，SDS－PAGE电泳分离样品，4℃转膜封闭后，加入相应一抗，4℃孵育过夜后，加入相应的二抗，室温、避光孵育1h，胶片曝光拍照。

1.4 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，凋亡敏感性数据以±s表示，2组间样本均数比较采用两独立样本t检验。

2 结 果

2.1 恶性胶质瘤细胞对TRAIL诱导凋亡敏感性原代培养恶性胶质瘤细胞株，经100μg·L－1TRAIL作用后检测细胞凋亡情况，发现3株原代培养的脑胶质瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感程度不同，GC321（0.12±0.01vs0.51±0.02）和GC125（0.22±0.01vs0.36±0.01）对TRAIL诱导凋亡作用敏感，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01），而 GC417（0.24±0.01vs0.23±0.02）对TRAIL诱导凋亡不敏感

2.2 恶性胶质瘤细胞DISC成分表达情况Western blotting法检测结果显示：在3株原代培养恶性胶质瘤细胞株中，DISC各成分均有表达，但略有不同，对TRAIL敏感的GC321细胞，DR5、caspase－8和Fas相关蛋白（FADD）表达均有增高，而对TRAIL不敏感的GC417细胞表达则明显减少（图1）。

图1 恶性胶质瘤细胞中DISC蛋白的表达Fig.1 Expressions of DISC proteins in glioma cells

3 讨 论

胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，其发病率并不高，但由于其隐匿性，一经发现绝大多数均为恶性，所以给临床治疗带来了很大困难。由于胶质瘤在脑内呈弥散性分布［5］，经手术难以清除，且现有的多种治疗方法对患者生存期的延长意义不大。研究［6－7］发现：恶性胶质瘤可能是由于激活了细胞的生长途径和／或抑制了细胞的凋亡途径而对治疗产生抵抗。TRAIL是肿瘤坏死因子超家族中的一员［8－9］，其在肿瘤免疫监视过程中起一定作用［10］，能诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对正常组织和细胞无明显毒性作用［11］，TRAIL的这一特性使之成为肿瘤治疗药物研究的热点。但研究［12－13］发现：在多种肿瘤细胞中存在着TRAIL抵抗现象，其发生抵抗的机制尚不清楚。

本实验通过对3株原代培养的恶性胶质瘤细胞进行研究，酸性磷酸酶法和Western blotting法检测结果显示：在3株原代培养恶性胶质瘤细胞株中，各细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性不同，DISC各成分表达也不同，对TRAIL敏感的GC321和GC125细胞中DISC成分表达明显增高；而对TRAIL不敏感的GC417细胞中其表达则减少。这说明不同来源的恶性胶质瘤细胞对TRAIL诱导凋亡的反应性不同，与DISC表达明显相关。因此，DISC的表达量减少可能与凋亡抵抗的发生密切相关，但其抵抗的机制，还需要进一步研究。

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Relationship between expression of death－inducing signaling complex and apoptosis induced by tumor necrosis factor related apoptosis－inducing ligand in malignant glioma cells

YU Hong－quan1，ZHANG Yu1，JIN Hong2，ZHAO Dong－hai2，YANG Shu－yan2，QI Ling2
（1.Department of Neurosurgery，First Hospital，Jilin University，Changchun 130021，China；2.Department of Pathology，Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

Objective To discuss the relationship between the expression of death－inducing signaling complex（DISC）and apoptosis induced by tumor necrosis factor related apoptosis－inducing ligand （TRAIL）in malignant glioma cells，and to explore the mechanism of resistance of TRAIL initiated apoptosis.Methods The primary cultured cells were isolated from human malignant glioma tissues，and the level of apoptotsis was detected by acid phosphatase assay after the cells treated with different doses of TRAIL；and the level of DISC protein was determined by Western blotting.Results The primary malignant glioma cells GC417，GC321and GC125were isolated and cultivated，and the sensitivities of the cells to TRAIL were different，GC321（0.12±0.01vs0.51±0.02）and GC125 （0.22±0.01vs0.36±0.01）were sensitive to TRAIL，there were significant differences compared with control group（P＜0.01）；but GC417（0.24±0.01vs0.23±0.02）was resistant to TRAIL.The results of Western blotting showed that the expressions of DISC proteins were various，and the expressions of GC321and GC125were increased，and the expression of GC417was decreased.Conclusion The responses are different according to the different primary malignant glioma cells to TRAIL－induced apoptosis，and the expressions of DISC proteins are either different；there is relationship between the decreasing of the expressions of DISC proteins and the resistance of TRAIL initiated apoptosis.

glioma；death－inducing signaling complex；tumor necrosis factor related apoptosis－inducing ligand；apoptosis

R739.4

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0904－03

2012－06－18

吉林省科技厅自然科学基金资助课题 （202015242）；吉林省教育厅科研基金资助课题 （2012330）；吉林医药学院科研基金资助课题 （201101）；吉林省吉林市科技发展计划项目资助课题 （201233128）

于洪泉 （1974－），男，吉林省长春市人，主治医师，医学博士，主要从事脑肿瘤研究。

齐 玲 （Tel：0431－88782331，E－mail：qiling1718＠163.com）