褐藻多糖硫酸酯对阿霉素肾硬化大鼠肾组织FN、TGF-β、MMP-9的影响*

陈雪风 吴汉利

（山东省潍坊市益都中心医院，山东 青州 262500）

慢性肾衰竭的病理基础是细胞外基质不适当的积聚［1］。已有部分临床资料表明褐藻多糖硫酸酯（FPS）能延缓慢性肾衰竭的进展［2］，但其作用机理尚不清楚。本实验通过建立阿霉素肾硬化大鼠模型，观察该药对实验性大鼠肾组织纤连蛋白（FN）、转化生长因子（TGF）-β、基质金属蛋白酶（MMP）-9 的影响，以探讨其对实验性肾小球硬化的防治作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级健康雌性SD大鼠40只，体质量（190±10）g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK－（军）2011－004。 大鼠自由饮水（水为清洁自来水）、摄食，室内温度控制在20～24℃，实验室湿度55%～60%，保持环境安静。

1.2 药品及试剂 海昆肾喜胶囊：吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司，每粒装0.22 g（含褐藻多糖硫酸酯 100 mg），批号：国药准字Z20030052。盐酸贝那普利：北京诺华制药有限公司，10 mg/片，批号：国药准字Z20030514。阿霉素：注射用盐酸多柔比星（阿霉素）：深圳万乐药业有限公司，10 mg/支，批号：国药准字H44024359。

1.3 模型制备 阿霉素肾病模型建立按Bertani等［3］法造模。适应喂养两周后，动物称体质量，固定，用酒精擦试尾部，使其尾静脉充分暴露，以1毫升注射器配7号针头，按照7 mg/kg体质量，抽取阿霉素注入尾静脉。如尾部无迂曲、肿胀则表示注射成功，正常组同法注射等量生理盐水。

1.4 分组及给药 成模大鼠随机分为模型组、盐酸贝那普利组、海昆肾喜组，每组10只。各组均自由饮水、摄食。大鼠用药量按照《实验动物学》计算，约为人1d剂量的20倍。正常组、模型组每天灌胃等体积生理盐水，盐酸贝那普利组按0.4 mg/（100 g·d）灌胃盐酸贝那普利，海昆肾喜组按20 mg/（100 g·d）灌胃海昆肾喜。实验结束模型组3只、盐酸贝那普利组2只、海昆肾喜组1只大鼠因腹泻、全身浮肿在造模2周内死亡。模型组尿蛋白平均（187.50±12.14） g/L，共喂养 8 周。

1.5 标本采集与检测 8周后大鼠放血处死，生理盐水经主动脉灌注，取腹正中切口，暴露并切除肾脏。肾脏冠状面取肾组织，甲醛固定石蜡包埋组织切片，厚度为2 μL，用于PAS染色、免疫组化。肾部分皮质用于Western blot检测。

1.5.1 肾脏系膜基质指数 肾组织切片经常规脱水、脱蜡后行PAS染色。光镜下观察肾小球及间质小管的病变程度。每张切片在400倍目镜下随机取6个完整肾小球，应用图像分析系统测定肾小球面积（G）与系膜基质面积（M），计算系膜基质指数（M/G），此值即为肾小球基质相对面积。

1.5.2 肾脏组织纤维连接蛋白（FN）光密度 肾组织切片经常规脱水、脱蜡后行免疫组化检测。棕色或者棕褐色着色面积作为阳性面积。应用计算机医学病理图像分析系统对肾脏组织切片的免疫组织化学染色的结果进行分析，在200倍光学显微镜下每个组织切片采集10个不重叠视野中的阳性染色面积，然后计算每个视野内的染色区域的平均光密度数值，数据汇总后应用SPSS统计分析软件进行分析。

1.5.3 TGF-β、MMP-9蛋白表达 用含蛋白酶抑制剂的组织裂解液（30 mmol/L Tris，pH 7.5，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L PMSF，1 mmol/L Na3VO4，1%Nonidet P-40，10%甘油） 在研磨器中研磨，离心取上清液即为总蛋白。每孔加75 μg总蛋白进行8%SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳，湿转仪湿转至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶室温封闭60 min，加一抗于4℃过夜。然后加相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗，室温反应120 min，用ECL化学发光剂（美国Santa Cruz）在X光片上曝光，显影、定影、冲洗晾干后扫描蛋白条带。以β-actin为内参，采用cymentre2000柯达活体成像仪进行定量分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS11.5统计软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义；两变量间相关关系采用双变量相关分析（Spearman相关系数）。

2 结 果

2.1 各组肾脏系膜基质指数 （肾小球基质面积Ms/肾小球面积Gs）变化 见表1，图1。与正常组相比，模型组、盐酸贝那普利组、海昆肾喜组肾脏系膜基质指数明显升高（P＜0.05或0.01）；与模型组相比，盐酸贝那普利组、海昆肾喜组肾脏系膜基质指数明显降低（P＜0.05或0.01）；海昆肾喜组肾脏系膜基质指数明显低于盐酸贝那普利组（P＜0.05）。

2.2 各组大鼠肾脏组织纤维连接蛋白（FN）光密度积分比较见表1，图2。与正常组相比，模型组、盐酸贝那普利组、海昆肾喜组肾脏FN光密度明显升高（P＜0.05或0.01）；与模型组相比，盐酸贝那普利组、海昆肾喜组FN光密度明显降低（P＜0.05或0.01）；海昆肾喜组肾脏FN光密度明显低于盐酸贝那普利组（P＜0.05）。

表1 各组肾脏系膜基质指数、FN光密度积分比较（±s）

表1 各组肾脏系膜基质指数、FN光密度积分比较（±s）

与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与盐酸贝那普利组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。下同。

组 别 系膜基质指数 FN光密度积分正常组 0.35848±0.005 0.164±0.013模型组 0.63023±0.017** 0.466±0.037**盐酸贝那普利组 0.52800±0.006**△ 0.249±0.027**△△海昆肾喜组 0.41637±0.012*△△▲ 0.207±0.009*△△▲

图1 各组8周肾脏系膜基质（PAS，×400）

图2 8周肾脏FN光密度改变（×200）

2.3 各组 TGF-β、MMP-9 Western blot结果比较 见表2，图3。模型组TGF-β蛋白表达增加、MMP-9蛋白表达下降，与正常组相比均有明显差异（P均＜0.01）；与模型组相比，盐酸贝那普利组和海昆肾喜组TGF-β表达下降、MMP-9表达上升 （P＜0.05或0.01）；海昆肾喜组TGF-β蛋白表达低于盐酸贝那普利组（P＜0.05），而MMP-9蛋白表达海昆肾喜组高于盐酸贝那普利组（P＜0.01）。

2.4 相关性分析 结果显示 TGF-β 值与 FN （r=0.769，P＜0.01）、系膜基质指数（r=0.856，P＜0.01）均呈正相关；MMP-9 值与 FN（r=-0.894，P＜0.01）、系膜基质指数（r=-0.699，P＜0.01）均呈负相关。

表2 各组 TGF－β、MMP－9 蛋白表达比较（±s）

表2 各组 TGF－β、MMP－9 蛋白表达比较（±s）

组 别 TGF-β（TGF-β/β-actin） MMP-9（MMP-9/β-actin）正常组 0.263±0.015 0.416±0.015模型组 0.447±0.026** 0.2321±0.011**盐酸贝那普利组 0.416±0.015**△ 0.327±0.019**△△海昆肾喜组 0.329±0.027△△▲ 0.394±0.021△△▲▲

图3 8周肾脏 TGF-β、MMP-9 Western blot结果

3 讨 论

阿霉素肾病模型（ADR）由 Bertani等［3］在 1982 年创建的，是研究人类局灶阶段性肾小球硬化的理想模型。模型组实验结束时出现大量蛋白尿，病理出现系膜基质明显增多，肾小球阶段硬化，提示局灶阶段性肾小球硬化模型造模成功。

FN是ECM的主要成分，其合成增多在肾脏纤维化早期即可出现明显变化。FN的合成可为其他ECM的沉积和胶原的形成提供一个支架，同时促进肾小球系膜细胞产生和分泌ECM增加［4］。因此FN可作为检测肾脏纤维化的主要指标之一。本研究发现FPS可明显抑制系膜基质的增生和FN的产生，与文献［5］报道类似。

肾小球内系膜基质积聚与细胞因子调控失衡引起的ECM合成增加和（或）降解减少密切相关［6］。TGF-β在细胞增殖及纤维化中具有重要作用，在促进基质沉积和组织硬化中是关键的细胞因子之一［7-8］。 另外，大量研究［9］证明，基质降解蛋白酶活性受到抑制是引起基质成分不断积聚，从而导致肾小球硬化的另一重要机制。而TGF-β具有降低MMP活性并增加此酶抑制剂TIMP活性，从而使基质降解减少［10-11］。本研究发现FPS可明显降低TGF-β表达，与报道类似［5］，同时提高MMP表达，相关性分析研究显示，TGF-β值与FN、系膜基质指数呈正相关；MMP-9值与FN、系膜基质指数呈负相关；提示海昆肾喜可能通过调控TGF-β及MMP-9表达，减轻FN沉积，从而抑制肾小球硬化，这为临床应用海昆肾喜治疗慢性肾脏病提供了理论依据。

［1］王海燕.慢性肾脏病及透析的临床实践指南［M］.北京：人民卫生出版社，2003：5.

［2］刘建春，郑法雷，刘燕萍.褐藻多糖硫酸酯对腺嘌呤致大鼠肾间质纤维化的干预作用及其机制探讨［J］.中国中西医结合肾病杂志，2008，9（2）：100-103.

［3］Bertani T，Poggi A，Pozzoni R，et al.Adriamycin-induced nephrotic syndrome in rats［J］.Laboratory Investigation， 1982，46：16.

［4］Ortega VR，Gonzalez RM，Ruiz-Torres MP，et al.Collagen Iupregulates extr celluar matrix gene expression and secretion of TGF-beta 1 byculturedhumanmesangialcells［J］.AmJPhysiolCell Physiol，2004，286（6）：C1335-C1343.

［5］薄守波，鞠建伟，李建远，等.褐藻多糖硫酸酯对人肾小球系膜细胞增殖及纤连蛋白与转化生长因子分泌的影响［J］.中华肾脏病杂志，2006，22（10） 638-639.

［6］Eng E，Floege J，Young BA，et al.Does extracellular matrix expnasion in glomeurlar disease require mesnagial cell proliferation? ［J］.Kidney Int，1994，45（Suppll）：45-47.

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