瘤胃中玉米秸秆分解菌的筛选

杨 琼，孙满吉，黄丽敏，朱继红，张永根

（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030）

我国是一个农业大国，大量农作物秸秆由于营养价值低、纤维素含量高，难于被畜禽利用，过多添加反而降低畜禽对其他营养物质的吸收利用，因此被就地烧掉，这不仅是一种资源浪费，而且对环境造成了一定的污染，当前如何提高秸秆的利用率成为畜牧业的热门话题[1]。目前畜牧业使用较多的为玉米秸秆，益生菌可在玉米秸秆上进行一系列复杂的生物化学作用，从而改变秸秆的物理、化学性质。可将玉米秸秆中的粗纤维降解为动物容易消化吸收的单糖、双糖等小分子物质，提高饲料的消化吸收率，这是机械所达不到的深度生化加工。与此同时，益生菌在处理玉米秸秆时还能产生并积累大量营养丰富的菌体蛋白及其他有用的代谢产物（维生素、微量元素、有机酸、醇、醛、酯等），增加了秸秆饲料的营养价值，提高了秸秆的适口性，有的代谢产物（如促生长因子）能提高动物抗病能力，刺激动物生长发育，有的代谢产物（如乙醇、乳酸等）对饲料还具有防腐作用。利用生物技术提高其饲用价值是国际上研究的热点，但目前对秸杆的利用还没有达到令人满意的水平[2-3]。至今，已有很多关于人工培养纯化纤维素降解菌方面的报道，其中大部分是以纯培养方法进行分离和筛选[4-6]。本试验通过对奶牛进行玉米秸秆的预饲，从而提高奶牛瘤胃中玉米秸秆分解菌的数量，通过刚果红培养基初筛与中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）降解率复筛的方法，在瘤胃液中筛选出对玉米秸秆降解率高的菌株，以期用该菌株作为益生菌添加剂来提高奶牛对玉米秸秆的利用率。

1 材料与方法

1.1 培养基

富集培养基（100 mL）：CMC-Na 1.0 g，K2HPO40.1 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，MnSO45×10-5g，蛋白胨1.0 g，酵母膏1.0 g，pH 6.4～6.8。

分离筛选培养基：CMC-Na 5 g，K2HPO41 g，NaNO33 g，MgSO40.5 g，琼脂 17 g，蒸馏水1 L，pH 6.4～6.8。

斜面活化保藏培养基：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂17 g，蒸馏水1 L，pH 6.4～6.8。

玉米秸秆培养基：玉米秸秆粉3 g，蒸馏水100 mL（固体培养则不加水），自然pH。

1.2 试验方法

1.2.1 鲜瘤胃液的采集

以玉米秸秆为粗饲料预饲4头已装置永久瘤胃瘘管的奶牛，预饲期为两周。晨饲（6:00）后2 h由4头瘘管牛瘤胃内上、下、左、右不同位点采集足量瘤胃液，混合并用两层纱布过滤，灌入经预热达39℃并通有CO2的保温瓶中，立即盖严瓶口，迅速返回实验室。

1.2.2 富集培养

取鲜瘤胃液1 mL接种至已灭菌的富集培养基中厌氧培养20 h。

1.2.3 菌株的初筛

取富集后的培养液做系列稀释梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5），分别涂布筛选平板，倒置恒温厌氧培养24 h，分离出能够旺盛生长，并在刚果红染色、NaCl脱色后可以观察到菌落周围有透明水解圈的菌株（用刚果红0.1%浸染15 min后，再用NaCl 1 mol·L-1水溶液脱色，刚果红可将未降解的CMC染成红色，而接种有纤维分解菌的菌落处形成了透明圈）。

1.2.4 菌株的复筛

挑取透明圈最大的11株菌，先在平板上进行连续划线纯化培养，纯化培养使用分离筛选培养基。将纯化后的菌株进行斜面活化保藏及富集培养20 h并计数。取富集培养后的11株菌的菌液10 mL，分别接入玉米秸秆液体培养基中，准确记录玉米秸秆粉的重量，每株菌做3个重复，厌氧恒温培养60 h，另做一个空白对照组，对照组不加菌液，而加入等量的无菌水。60 h后将玉米秸秆培养物用定量滤纸过滤，60℃烘干，回潮后称重，通过测定处理后玉米秸秆粉的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维，筛选出对玉米秸秆纤维分解率最大的1株瘤胃菌。

1.2.5 菌株的保藏

将选出的菌株在平板上连续划线纯化培养40 h，然后接入含斜面活化保藏培养基的试管中，培养40 h后放入冰箱中保藏。

1.2.6 菌株表型特征鉴定

用接种环挑取少许新鲜的菌丝涂布在干净玻片上的1滴无菌水或是蒸馏水中，风干固定，染色。用光学显微镜观察菌株的形态特征。

1.3 统计分析

试验数据采用Excel进行分析，结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选

通过刚果红筛选培养基从瘤胃液中筛选出11株透明圈大的纤维分解菌。并将11株菌进行了纯化。复筛时以测定处理后玉米秸秆粉的中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维为指标，选出对玉米秸秆纤维分解率最大的1株瘤胃菌该菌的编号为Q3，该菌株20 h富集培养液的菌数为2.3×1015个·mL-1。测得处理前后的NDF与ADF含量平均值见附表。

附表 Q3菌株处理前后玉米秸秆中NDF、ADF含量%

由附表可以看出，处理后NDF含量从84.72%降低到了77.35%，Q3菌株使玉米秸秆中的NDF含量降低了7.37个百分点，ADF的含量从51.85%降低到44.78%，降低了7.07个百分点。

本试验发现，刚果红培养基上透明圈的大小并不能说明纤维菌对玉米秸秆的降解率大小，本次筛选出的分解率最大的菌株Q3，其透明圈并不是最大的，这是因为刚果红培养基上的透明圈是因为菌株分解了羧甲基纤维素钠的原因形成的，菌株对羧甲基纤维素钠的分解只能说明其内切葡聚糖酶活力大小，而菌株分解纤维的能力并不只是由内切葡聚糖酶的活力大小决定的，其是由多种酶的特定比例而决定的。

2.2 菌株的表性特征鉴定

本试验所筛出的Q3菌在CMC-Na培养基上的表型特征见图1，显微镜下观察的Q3菌株特征见图2。

图1 CMC-Na培养基上的Q3菌株

图2 显微镜下的Q3菌株

由图1～2可见，Q3菌株的表型特征为菌落边缘不规则、呈辐射状、为乳白色、显微镜下观察菌体形态为短杆状、革兰氏染色结果显示为革兰氏阳性菌。

3 小结

白腐真菌以其强大的降解能力闻名，经白腐真菌发酵的秸秆，不仅粗纤维含量大幅度下降，而且粗蛋白质水平也大幅度提高。侯进等在74%的玉米秸秆和1%的石灰中分别添加不同配比的玉米面和麦麸生产的白腐真菌曲种来发酵奶牛常用粗饲料玉米秸秆，筛选出以玉米秸秆为主料生产白腐真菌菌种的最佳配方，结果表明，各处理组菌种均能发酵玉米秸秆，降低粗纤维含量，提高粗蛋白质含量；菌种培养基对发酵玉米秸秆粗蛋白质含量影响极显著（P＜0.01），对粗纤维含量影响不显著（P＞0.05）；74%的玉米秸秆和1%的石灰添加5%的玉米粉、20%的麦麸配合生产的白腐真菌曲种对玉米秸秆的发酵效果最好，可降低生产成本，更适宜作为生产白腐真菌菌种的配方[7]。

本试验得到的纤维分解菌对玉米秸秆有一定的降解作用，该菌株是否适合用作益生菌添加剂还有待进一步研究。随着世界人口的日益增多，“人畜争粮”的问题日益严重，提高农作物副产品——秸秆的利用率迫在眉睫，纤维分解菌的研究已引起了世界学术范围内的广泛关注，在饲料行业中，纤维分解菌目前还存在菌种种类少、研究进展缓慢、菌株不稳定、市场处于待开发状态、技术水平较低，存在安全隐患、标准不健全等一系列问题，今后还需进行更深入研究和探讨，以促进反刍动物的饲养业的健康发展[8]。

[1]宫福臣,杨琼,李杰.不同秸秆处理技术及在反刍动物中的应用研究进展[J].中国饲料,2011（19）:28-30,44.

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[7]侯进,李婷,李杰.白腐真菌降解玉米秸秆的研究[J].饲料博览,2010（1）:4-7.

[8]张景玉,黄保华,殷若新.微生态制剂——益生素的应用及发展前景[J].山东家禽,2001（5）:33-35.