黄皮素内酯Ⅱ在黄皮植物体的分布及对稗草生化代谢的影响

卢海博， 万树青

（1.农药与化学生物学教育部重点实验室，华南农业大学昆虫毒理研究室，广州 510642；2.河北北方学院农林科技学院，张家口 075131）

随着生产力水平的提高，我国除草剂发展迅速，但大部分除草剂是化学合成药剂，施用以后由于化学残留问题经常对下茬作物造成药害，所以开发高效、低毒、对环境安全的除草剂就非常重要。从植物中寻找具有农药活性的化合物，是开发环境和谐农药的一条重要途径［1－5]。众所周知，以天然除虫菊和烟碱为先导化学物，人工合成开发出现代拟除虫菊酯类和新烟碱类杀虫剂并已取得广泛的应用就是一个很好的例子。

黄皮为芸香科（Rutaceae）黄皮属（Clausena）植物。本属植物全世界约有30种，分布于热带、亚热带地区，我国有近10种，分布于长江以南各省，以云南南部、广东、广西、海南及台湾等省分布较为集中，资源丰富。黄皮为南方特有的水果并兼有药用价值，具有保肝降脂、解痉、抑菌及抗癌等生物活性［6－7]。除药用外，人们也在农业应用方面展开了一系列的研究，徐汉虹［8]等发现齿叶黄皮（Clausena dunniana Lévl.）精油具有杀虫作用并分离得到其杀虫主要成分为爱草脑。万树青［9－10]等发现，黄皮［C.lansium（Lour.）Skeels]果核甲醇提取物对农田主要杂草具有抑制生长活性。对黄皮的甲醇提取物进行研究，并采用活性跟踪的方法对其活性成分进行分离，具有除草作用的化合物为黄皮素内酯Ⅱ（2′，3′－epoxyanisolactone，结构为图1）。结果表明，在80μg／mL时，黄皮素内酯Ⅱ对稗草 （Echinochloa crusgalli Linn.）的根长、茎长和鲜重抑制率分别为96.00%、84.71%和89.85%，其IC50值分别为66.9、78.4μg／mL和133.0μg／mL［11－12]。表明黄皮素内酯Ⅱ对稗草具有显著的抑制活性，作为植物源除草剂具有一定的开发和应用前景。黄皮素内酯Ⅱ在国内为首次从黄皮中分离并确定其具有除草活性，为了科学合理利用黄皮资源，为开发新型除草剂提供依据，作者对黄皮植株地上部位黄皮素内酯Ⅱ的含量进行测定，并测定该化合物对稗草生理生化代谢的影响。

1 材料和方法

1.1 试验材料

稗草（E.crusgalli L.）属禾本科，稗属。种子采于华南农业大学农场，置于冰箱内4℃保藏备用。

黄皮素内酯Ⅱ：黄皮的果核、枝叶和花分别采自华南农业大学昆虫毒理室标本园，在花期采集枝叶和花，成熟期采集种子，阴干后粉碎，用甲醇浸泡提取，m（粉碎物）∶V（甲醇）＝1∶3，旋转蒸发仪浓缩后得其粗提物，然后对粗提物进行硅胶柱层析和薄层层析后，分离纯化得白色结晶，经核磁共振氢谱（1HNMR）（500MHz）和核磁共振碳谱（13CNMR）（125MHz）分析后，综合以上特征并参考文献报道鉴定为黄皮素内酯Ⅱ（由中国科学院华南植物园魏孝义研究员进行结构鉴定）。

图1 黄皮素内酯Ⅱ

1.2 黄皮素内酯Ⅱ含量的测定

标准工作曲线的制作：称取黄皮素内酯Ⅱ，用甲醇（100%）分别配制200、100、50、25μg／mL和12.5μg／mL的标样，过滤后经HP－1100型高效液相色谱仪（美国惠普公司生产）进行检测，在212nm检测各浓度的峰面积和出峰时间，重复3次，建立相应的色谱条件。并以物质浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。

色谱条件：色谱柱为HP Hypersi ODS C18250×4.0mm（i.d）5μm；柱温：室温；流动相：V（甲醇）∶V（水）＝75∶25；流速：1.0mL／min；检测波长：212nm；进样量10μL；保留时间：约3.906min。

分别配制黄皮素内酯Ⅱ的浓度梯度，浓度分别为200、100、50、25、12.5μg／mL，在上述检测条件下测定各浓度的峰面积，以其浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

在仪器完全稳定的状态下，取一含量为98.52%黄皮素内酯Ⅱ的样品，连续进样6次，计算出标准偏差和变异系数。

5mL浓度为100μg／mL黄皮素内酯Ⅱ样品溶液中，添加浓度为100μg／mL黄皮素内酯Ⅱ标准品3、4、5、6、7、8mL，则添加的质量分别是0.300、0.400、0.500、0.600、0.700mg和0.800mg，进样分析后，扣除样品中原有的黄皮素内酯Ⅱ的含量，计算分析方法的准确度。

含量的测定：分别称取0.05g枝叶、花和果核的粗提物各3份，用10mL甲醇（100%）溶解，微孔滤膜（孔径0.45μm）过滤后，采用上述液相色谱条件进行检测。

1.3 氨基酸总量的测定

参考山东农业大学的方法［13]，稍加改进。

药剂的设计：称取一定量的甲醇萃取物，用1mL N，N－二甲基甲酰胺和少量吐温－80溶解后，加蒸馏水配成0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25mg／mL 5个浓度，以1mL N，N－二甲基甲酰胺和少量吐温－80为对照。

稗草的培养（小杯法）：取25mL的小烧杯，往杯内加入小玻璃珠，以铺满烧杯底部为宜，振动小烧杯使玻璃珠面达到平整，再往珠面上垫上一层新华牌定性滤纸，滤纸大小与杯口内径大小一致，选取发芽一致的稗草种子20粒，用镊子均匀地放在滤纸上，烧杯内加入5mL配制好的不同浓度的萃取物液，重复3次，放在光照培养箱中28℃恒温下培养。10d后观察结果。

氨基酸样品提取液的制备：10d后取出各处理的稗草植株，用剪刀剪下叶片和根部，并将其剪成碎片（2mm左右）。迅速称取样品0.15g，重复3次，加入10mL蒸馏水，加热至沸，冷却后用单层滤纸过滤备用。

样品氨基酸含量的测定：吸取上述样品提取液1mL，加入1mL水合茚三酮溶液，在80℃恒温水浴中加热15min，取出后用pH5.0的柠檬酸缓冲液稀释至10mL，在721型分光光度计610nm处测定吸光密度值，再从标准曲线上查出相应的氨基酸微克数。根据公式分别求出每克鲜样品含氮量，根据公式计算含氮量比。

式中，C为由标准曲线查出每毫升提取液中氨基态氮含量（微克）；Vt为样品提取液经稀释后的体积（mL）；L为测定时取样品液毫升数；W 为样品。

1.4 样品蛋白含量的测定

以牛血清白蛋白为标准蛋白，按照邹琦［14]的方法进行蛋白含量的测定：前处理方法同1.3，称取稗草植株0.15g，重复3次。放入研钵中，加入1.5mL蒸馏水，研磨成匀浆，－4℃13 000r／min下冷冻离心15min。吸取上清液0.02mL放入具塞试管，加入5mL考马斯亮蓝G－250溶液和0.98mL蒸馏水，在595nm下测定A值，查得蛋白含量。按公式计算样品中的蛋白含量。

式中，C为查标准曲线值（μg）；Vt为提取液总体积（mL）；W 为样品鲜重（g）；V1为测定时加样量（mL）。

2 结果与分析

2.1 黄皮素内酯Ⅱ在黄皮不同组织中的含量测定

在给定的液相色谱检测条件下测定各浓度的峰面积，以其浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到黄皮素内酯Ⅱ的高效液相色谱工作曲线为y＝37.936x＋94.54，相关系数为R＝0.999 9。

在仪器完全稳定的状态下，取一含量为98.52%的样品，连续进样6次，计算出标准偏差0.145 1，变异系数0.147 2%。

添加一定质量的黄皮素内酯Ⅱ标准品进样分析后，扣除样品中原有的黄皮素内酯Ⅱ的含量，测定出回收率分别是98.49%、100.18%、99.68%、99.72%、100.09%和99.73%，平均回收率为99.65%。

分别配制黄皮的花、枝叶和果核的粗提物1 000μg／mL的浓度，在设定的检测条件下测定各部分中化合物黄皮素内酯Ⅱ的含量，测定结果见表2。结果表明，黄皮素内酯Ⅱ在花粗提物中的含量较少，仅为0.43%，在枝叶和果核中的含量分别为3.33%和3.21%。这说明黄皮素内酯Ⅱ在黄皮枝叶和果核中的含量较高，且枝叶材料容易获取，为从枝叶中提取黄皮素内酯Ⅱ的可行性提供了条件。本试验所用材料枝叶和花取于花期，果核取于成熟期，所以枝叶中黄皮素内酯Ⅱ的含量较高是仅限于花期这个时期取样的。

表1 化合物黄皮素内酯Ⅱ在黄皮不同组织的含量1）

2.2 对稗草氨基酸代谢的影响

植物根系吸收、同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式进行运输，测定氨基酸总量是研究植物根系生长和整个生长发育的一个指标。黄皮素内酯Ⅱ在设定的0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25mg／mL的浓度梯度下，对稗草植株中的氨基酸含量有一定的影响，样品含氮量分别为1.402 8、1.317 2、1.250 2、1.128 7mg／g和0.903 2mg／g，比对照0.832 1mg／g均有所增加，且各处理与对照差异显著。试验结果表明黄皮素内酯Ⅱ使稗草的氨基酸含量有一定的增加，氨基酸是合成蛋白质等营养物质的基础，而试验中观察到处理稗草表现为顶端生长点钝化、畸形，植株矮小，根部不发达，表现出营养供应不足。分析原因可能是黄皮素内酯Ⅱ阻碍了稗草氨基酸转化为蛋白质的过程，使氨基酸在一定时期内表现为积累。

表2 黄皮内酯Ⅱ处理稗草氨基酸含量的变化

2.3 对稗草植株蛋白代谢的影响

分别设定0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25mg／mL 5个浓度梯度处理稗草植株。结果表明，各处理稗草的蛋白含量与对照相比都有所下降，在处理浓度下，蛋白含量比对照分别降低75.91%、66.43%、62.43%、58.57%和58.03%。且各处理蛋白含量均与对照差异显著。这一结果结合2.2中的结果表明黄皮素内酯Ⅱ对稗草植株内氨基酸转化为蛋白质有一定的影响，导致蛋白含量降低，从而影响到稗草的正常生长。

表3 黄皮素内酯Ⅱ处理稗草蛋白含量的变化

3 讨论

化学除草不仅造成环境污染，还会对作物或非靶标生物产生药害以及产生严重的抗药性问题。植物次生代谢物质是生物间协同进化的结果，易于在自然界循环中降解，而且次生代谢物质具有多样性和复杂性的特点，不容易产生抗性。因此，从自然界生物中寻找具有除草活性的化合物，已成为研发环境相容性除草剂的一条重要途径。例如，除草剂环庚草醚（通用名为cinmethylin）是来源于植物性化合物1，4－桉树脑；而捷利康公司开发的新型除草剂Triketones，则是来自植物的次级代谢产物Leptospermone。天然产物不同寻常的结构特征使其拥有与传统除草剂不同的作用靶标［15－16]。因此，对有植物毒性的天然产物进行研究，有望发现具有新型作用机制的除草化合物，从而开发出新型安全的除草剂。

除草活性测定表明，黄皮植物体内次生代谢产物黄皮素内酯Ⅱ对稗草生长具有显著抑制作用，经过测定它主要分布在植物的枝叶内，这为合理利用这种化合物提供了依据。黄皮素内酯Ⅱ在国内首次从该植物中分离，经试验测定对稗草植株生长具有很好的抑制活性。本试验研究结果表明，经黄皮素内酯Ⅱ处理后，稗草植株内的氨基酸含量升高，蛋白含量降低，这是稗草植株在受到刺激后，体内的蛋白质代谢受到干扰，很可能是黄皮素内酯Ⅱ抑制稗草植物生长的作用机制之一，为寻找新的除草靶标，开发新农药奠定基础。

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