洛阳牡丹新病害—柱枝孢叶斑病

赵 丹， 康业斌

（河南科技大学林学院，洛阳 471003）

洛阳牡丹新病害—柱枝孢叶斑病

赵 丹， 康业斌＊

（河南科技大学林学院，洛阳 471003）

为了明确河南省洛阳地区牡丹叶部一种新病害的病原种类，对采自田间的典型症状叶片进行了常规组织分离，对单孢菌株进行了形态鉴定、rDNA ITS序列分析及致病性测定。结果表明，病原菌在PDA培养基上菌落初期白色绒毛状，后期红褐色。分生孢子梗通常呈扫帚状，有2～3个分支，末端膨大呈泡囊状。分生孢子直棒状，两端钝圆，有0～1个隔膜，大小为（38.4～86.4）μm×（4.6～5.9）μm，平均60.1μm×5.2μm。离体叶片与活体植株接种结果表明，该菌均能侵染牡丹叶片并引起与田间相同的症状。据此将分离物鉴定为Cylindrocladium canadense，将该病害命名为牡丹柱枝孢叶斑病。

牡丹； 叶斑病； 柱枝孢

牡丹（Paeonia suffruticosa）为我国的传统名花，属芍药科、芍药属、落叶型的亚灌木，花大色艳，国色天香，深受大家的喜爱。近年来，种植面积不断扩大，引进品种日益增加，牡丹病害危害也呈现上升趋势，严重影响了牡丹的观赏价值，制约了牡丹产业化发展的进程［1－3］。2008年－2010年在对洛阳地区牡丹叶部真菌病害调查过程中发现了一种新病害，该病初期病斑深褐色，单个圆形，水渍状边缘明显，后期病斑相连逐渐扩大成不规则形（图1），叶片正面深褐色，背面浅褐色，高湿时叶片背面产生白色菌丝。为了明确引起该病害的病原种类，对典型症状叶片进行了病原分离，将分离、纯化的菌株进行了形态鉴定、rDNA ITS序列分析及致病性测定，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 病原菌分离、纯化与培养

病害标本于2010年10月采自洛阳市中国国花园，利用组织分离法［4］进行常规分离。分离物进行单孢纯化后，在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上25℃下恒温培养，观察其培养特征。3～5d后显微观察分生孢子梗、分生孢子的形态。

1.2 致病性测定

离体叶片接种：选取12个健康的牡丹叶片，用无菌水反复洗净后放置于培养皿中的滤纸上，培养皿底部用含无菌水的脱脂棉和滤纸保湿；将培养7d后的菌落，加入无菌水配制孢子悬浮液并调节浓度至2×106个／mL，用涂抹法接种到9个叶片上，另外3个叶片以无菌水作为对照；在25℃，L∥D＝12h∥12h，恒温保湿培养。

活体植株接种：在牡丹植株上选取12片健康叶片，用70%乙醇擦洗后用无菌水冲洗3次，用脱脂棉球蘸取上述孢子悬浮液后置于9片叶上，以脱脂棉球蘸取无菌水置于另外3片叶上作为对照，用塑料薄膜覆盖整株后，25℃，L∥D＝12h∥12h，恒温保湿培养。

1.3 rDNA ITS序列测定

取在PDA培养基上培养5～7d的菌丝体，用CTAB 法［5－6］提取 DNA，琼脂糖凝胶电泳检测 DNA。利用通用引物ITS1和ITS4将提取出来的DNA进行PCR扩增，设计25μL PCR反应体系，反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸105s，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，4℃下保存，将扩增产物电泳，以凝胶成像系统检测并记录扩增产物在琼脂糖凝胶上的图谱。然后，进行rDNA ITS区域的序列测定，将所得序列整合后在GenBank上进行BLAST比对。

图1 柱枝孢叶斑病田间症状

2 结果与分析

2.1 分离物的形态学特征

单孢分离物在PDA培养基上初期菌落白色，圆形，边缘较齐整，气生菌丝茂盛，绒毛状，后期菌落中央由于产生色素变为红褐色（图2）。在PDA培养基上培养2～3d后产生分生孢子梗，具分隔，分生孢子梗多作2～3次分支，呈扫帚状，主梗顶端膨大呈泡囊状（图3a）；有的分生孢子梗呈扫帚状，但无主梗（图3b）。分生孢子无色，直棒状，两端钝圆，有0～1个隔膜，大小为（38.4～86.4）μm×（4.6～5.9）μm，平均60.1μm×5.2μm（图3c）。培养后期菌落产生大量红褐色的厚垣孢子（图3d）。

2.2 致病性

被接种的叶片均在2d后出现症状，初期形成褐色小圆斑，周围水渍状，后期病斑扩大，数个病斑扩展连成一个不规则形褐色病斑（图4）。5～7d后病斑正面中央常呈灰白色，用刀片刮下镜检可观察到大量分生孢子，湿度大时，叶片背面产生白色菌丝。将接种病斑再分离，重新获得病原菌。

图4 柱枝孢叶斑病室内接种症状

2.3 ITS序列分析

将所得序列整合后在GenBank进行BLAST比对，结果表明，该序列（序列号为JF418968）与在DNA序列库中登录号为AF348256.2和AF348244.2的Cylindrocladium canadenseITS区段DNA序列的同源性为100%。

3 结论与讨论

根据分离物的形态特征、rDNA ITS序列分析及致病性测定，将引起牡丹叶部病害的病原菌鉴定为Cylindrocladium canadense，属于柱枝孢属真菌。将该病害命名为柱枝孢叶斑病。该病原菌与Li［7］等从山东菏泽牡丹病株上分离得到的病原菌相一致，但在洛阳为首次发现。国外报道，该病菌还能够引起草莓和珊瑚钟等植物叶斑病［8－9］。

［1］ 张宗岩.牡丹叶斑病的初步观察及防治［J］.中国园林，1991，7（4）：53-55.

［2］ 于梅娥，徐敬杰，吕金刚，等.洛阳牡丹根部病虫害种类及防治［J］.植物检疫，2001（6）：377-378.

［3］ 段亚冰.牡丹叶斑病病原真菌鉴定及生物学特性研究［D］.洛阳：河南科技大学，2009.

［4］ 方中达.植病研究方法［M］.第3版.北京：中国农业出版社，1998.

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［6］ 赵思峰，方许阳，姜海荣，等.新疆加工番茄腐霉根腐病病原鉴定及其rDNA的ITS区段分析［J］.植物保护学报，2009，36（3）：219-224.

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The new leaf spot of peony caused byCylindrocladium canadensein Luoyang，China

Zhao Dan， Kang Yebin
（College of Forestry，Henan University of Science and Technology，Luoyang471003，China）

In order to determine the pathogen of a new leaf spot of peony in Luoyang，Henan，the pathogen was isolated from the leaves with typical symptoms，and the strains of the single spore were identified with morphological characters and DNA sequence analysis，and tested according to the standard Koch’s postulation methods.The results showed that on PDA，colony was white and orbicular，but gradually turned to red brown.Conidiophores had di-or trichotomic branches，the terminals of which expanded and formed a vesicle.Conidia were cylindrical，straight with rounded ends，with0－1 dissepiments，smooth and（38.4－86.4）μm×（4.6－5.9）μm，and the average was 60.1μm×5.2μm.The results of inoculation on the leaves in petri dishes and in living peony bodies showed that the strains could infect peony leaves and cause the same symptoms as in fields.Consequently，this pathogen was identified asCylindrocladium canadense.And this disease was named as theCylindrocladium canadenseleaf spot.

Paeonia suffruticosa； leaf spot；Cylindrocladium canadense

S 436.8

A

10.3969／j.issn.0529-1542.2012.01.039

2011-04-11

2011-05-12

河南科技大学博士启动基金项目（200709001215）；河南省科技厅重点科技攻关项目（102102110090）

＊ 通信作者 Tel：0379-64270236；E-mail：kangyb999＠163.com