水产饲料造粒过程中三聚氰胺形成机理的研究

林建云 王海燕 林 涛 王玮玮 许艳红

饲料安全是动物源性食品安全的关键，即食品安全之前提。自从2007年3月在美国发生的宠物“毒粮”事件[1]以及2008年“三鹿奶粉”事件[2]，在中国乃至世界范围内均引起三聚氰胺的恐慌。饲料安全再次引起了全社会的高度关注。

三聚氰胺(Melamine，简称MA)，学名三氨三嗪、氰脲酰胺，俗称蜜胺，是一种化工中间体产品，主要用于三聚氰胺－甲醛树脂的生产。MA产品广泛应用于木制品、塑料、涂料、造纸、纺织、餐具和医药器具等行业，与人类现代生活密切相关[3]。MA的毒理学研究认为，其在动物机体内属于惰性代谢,对生态环境的潜在危险性较小[4]；尽管MA对人类直接造成危害的可能性很低，但与其同系物潜在危险性仍然引起人们的关注[5－7]。对于鱼类的毒性研究结果也表明，饲喂高含量MA的饲料会降低鱼类的摄食与生长，并损伤鱼类的肾脏[8－10]。

MA是不允许在食品和饲料中添加的化工产品。但是，由于其高含氮量（CN=66.66%；相当于416.6%蛋白质的含氮量）以及检测难度较大的特点被一些不法蛋白原料生产商所利用，为达到提高原料蛋白质检测值而盈利的目的，MA等高含氮化合物被掺假到蛋白饲料原料中，并称之为“蛋白精”[11－12]。由于水产动物对蛋白营养的需求量较大，蛋白原料在水产饲料中所占的比例要远大于陆生动物饲料,因此,MA对水产饲料的影响势必更加显著。

自美国宠物“毒粮”事件发生后，出口的动物性食品及其养殖过程所使用的饲料均必须进行MA等卫生指标检测并备案。2007～2008年，厦门市饲料企业在报备出口水产品所使用水产饲料的卫生检测中发现：所送检的颗粒水产饲料几乎均检出三聚氰胺（CMA2～12 mg/kg）。饲料中MA问题似乎已经成为出口动物源性食品和饲料的限制因子。

然而，如果饲料中仅加入1.0%含有2400 mg/kg三聚氰胺（相当于1%粗蛋白质检测值）的原料，则饲料中的CMA可达24 mg/kg以上，且在饲料原料中可检测出高含量的三聚氰胺。用确定未检出三聚氰胺的原料进行挤压造粒，其产品中仍然会检出CMA(3～5 mg/kg)。以多种挤压膨化机进行饲料造粒前、后CMA对比试验，均发现饲料在造粒过程中产生三聚氰胺增加量(ΔCMA)的现象。为探讨饲料造粒过程产生三聚氰胺的机理，摸清挤压造粒过程中产生三聚氰胺的主要影响因素，并提出降低形成三聚氰胺的水产饲料生产方案，本项目于2009年10月开始进行了以下试验与研究。

1 试验仪器与方法

1.1 设备、材料和仪器

1.1.1 挤压膨化机

MY－146型双螺杆挤压膨化机，申川－200型单螺杆挤压膨化机，YF－165型单螺杆挤压膨化机，WENGER－165单螺杆挤压膨化机，HX－双螺杆挤压膨化机（自制），EXT－155G单螺杆挤压膨化机（干法）。

1.1.2 试验材料

水产配合饲料；尿素，AR级；缩二脲，饲料级、化工级。

1.1.3 检测仪器

Agilent LC－MS/MS液相色谱－串联质谱测定仪；722－智能分光光度计；XSP－2C 生物显微镜，K－437电热消解仪；半微量凯氏定氮仪。

1.2 方法

1.2.1 采样

所有的采样均以不锈钢勺为采样工具，采集的样品储存于250 ml磨口玻璃瓶中密封保存，并填写采样记录表。

1.2.2 测定方法

CMA采用 LC－MS 法[13]、LC－MS/MS 法进行测定[14]；尿素以分光光度法进行测定[15]；缩二脲以分光光度法进行测定[16]；粗蛋白[17]、盐基氮[18]以凯氏定氮法测定。

1.2.3 饲料造粒过程ΔCMA试验

分别对2种类型（单螺杆挤压机、双螺杆挤压机）的6种不同造粒机进行了18批次在线试验。饲料于造粒前所采集的粉状饲料作为三聚氰胺含量本底样（CMA－B），对其造粒后所采集成品饲料作为三聚氰胺含量对比样（CMA－A），进行三聚氰胺含量测定以及三聚氰胺增量（ΔCMA=CMA－A－ CMA－B）的计算与统计。

1.2.4 尿素对饲料造粒过程的ΔCMA影响试验

拟定尿素添加量为试验饲料量的0.50%；所添加的尿素先与其它饲料添加剂预混合后，再与基础饲料一同搅拌均匀。经混合后的饲料在进入调质器之前按不同时间段进行采样作为膨化前的参照样；也按不同时间段采集该批次造粒后的饲料成品为试验对比样。同时，进行不添加尿素的造粒前、后的对比试验作为比较。

1.2.5 饲料中添加饲料级缩二脲的模拟试验

以牛蛙粉状饲料为底物，分为不添加缩二脲的空白参照组与添加0.5%缩二脲的试验对比组；并根据饲料造粒过程的温度范围设定试验温度为100、150和200℃三个对比试验组。参照饲料造粒过程调质后的水分含量，调节试验样品的水分含量约为25%。试验对比组样品于不锈钢搅拌器中加入缩二脲，高速搅拌2 min后，转移到抗腐蚀性较强的金属钛管反应器中，并密闭反应器，置于流体化沙浴中加热；达到预定温度时，保持恒温20 min后取出。加热试验后反应器自然冷却至室温，开启密封盖，把试验饲料样品转移至玻璃样品瓶中密封保存。

2 结果与讨论

2.1 饲料原料中三聚氰胺背景值的调查

饲料原料安全即是饲料产品安全的基本保障。本研究从一开始就着重于对我国水产饲料普遍使用的原料进行了广泛的样品采集和CMA测定，结果见表1。从CMA的测定结果可以看出,经历了饲料行业三聚氰胺专项整治后,饲料原料的三聚氰胺问题基本得到遏制。植物籽实类产品中CMA均低于饲料中三聚氰胺测定方法（NY/T 1372—2007）的最低定量限(0.05 mg/kg)[19]；植物源性蛋白原料、酵母粉、海藻粉的CMA大多数在0.25 mg/kg以内，最高检测值为0.50 mg/kg。动物性蛋白原料及鱼油的CMA也多数低于0.25 mg/kg；唯一国产鱼粉的CMA（20.8 mg/kg）超出饲料中三聚氰胺的限量 (CMA＜2.50 mg/kg)规定。

表1 饲料原料中三聚氰胺含量的检测结果

2.2 水产饲料产品中三聚氰胺背景值的变化趋势

2009年10～12月，对水产饲料中CMA的背景值调查共测定了58个饲料样品，其中粉状饲料25个，颗粒饲料33个，饲料中CMA测定统计结果见表2。从表2可以看出，水产颗粒饲料中CMA范围明显低于2007～2008年的检测结果；粉状饲料的CMA明显小于颗粒饲料，且出现基本配方与物料相同的颗粒料CMA明显高于其粉状料的结果。颗粒饲料中CMA变化幅度较大，其中有6个CMA＞2.5 mg/kg，CMA超标率占总检测量的10.3%；若以颗粒饲料量计，超标率则为18.2%。

表2 2009～2011年度水产饲料中三聚氰胺含量的检测结果

2010年，再次对福建省8家饲料加工企业生产的77个水产颗粒饲料和15个观赏鱼颗粒饲料进行CMA测定和统计（见表2）。92个产品中CMA指标合格率为93.5%；其中水产颗粒饲料的合格率达97.4%，CMA均值也较2009年底下降了3.4倍。而出现6个CMA超标的样品中有4个样品来自于同一企业生产的观赏鱼膨化饲料（CMA：9.20～22.0 mg/kg），另外 2 个出现于牛蛙膨化饲料和乌龟膨化饲料中。6个超标饲料的CMA统计值为(10.96±5.58)mg/kg，均超过合格产品CMA均值的数十倍。且CMA超标的观赏鱼饲料均出现于2010年5月（饲料级缩二脲生产许可证注销期限）之前。

2011年1～8月，对33个水产颗粒饲料进行产品中CMA回顾性检测，均未发现三聚氰胺含量超标[CMA为0.01～2.10 mg/kg；统计值：(0.170 ± 0.414)mg/kg，n=33]的现象出现；85%检测样品的CMA低于FDA的限量(CMA＜0.25mg/kg)要求；CMA均值也较2010年下降了2倍。

对水产饲料产品中三聚氰胺背景值变化趋势的研究发现，自2009年国家对饲料中三聚氰胺问题的专项整治之后，饲料原料及产品中的三聚氰胺含量发生了历史性的变化。同时，从颗粒饲料的CMA与粉状饲料的明显差异说明：饲料在挤压造粒过程可能产生三聚氰胺的增量。

2.3 饲料造粒前后三聚氰胺含量的比较试验 (见表3、表 4)

表3 单螺杆膨化机制粒前、后饲料中三聚氰胺的检测结果

表4 双螺杆膨化机制粒前、后饲料中三聚氰胺的检测结果

饲料于造粒过程产生三聚氰胺增量至今未见报道。为了提供更加充分、翔实的依据证实这种现象的存在，本项目组于2010年6～8月，分别6次对两种类型的6台膨化造粒机进行了18批次在线采样。以相同批次，于饲料造粒前采集的粉状饲料作为本底样品，对其造粒后的饲料成品进行CMA对比试验。对比试验不设任何前提条件，于饲料企业的加工流水线上直接采集在线生产的饲料作为对比试验样品。样品除了以LC－MS/MS方法进行CMA测定外，尚进行粗蛋白质含量（CP）等常规组分以及挥发性盐基氮（VBN）的测定。

从表 3～表 4 中各种饲料 CMA－B与 CMA－A的检测结果可以看出，两种类型挤压膨化机在造粒过程均产生ΔCMA。单螺杆挤压机所产生的增量（ΔCMA：0.028～0.080 mg/kg；均值为0.049 mg/kg）较小；双螺杆挤压机造粒过程所产生的ΔCMA(0.046～2.336 mg/kg；均值为0.700 mg/kg)较大；福建省水产饲料研究会于2009年12月进行的鲳鱼饲料造粒对比试验的饲料中CMA本底值与ΔCMA[(4.55±0.74)mg/kg]均相对更大。造粒对比试验的结果同时表明，造粒过程的ΔCMA与CP、VBN之间没有明显的相关，而与饲料中MA的残留背景值密切相关。

2.4 尿素对饲料造粒过程的三聚氰胺增量的影响试验

三聚氰胺的工业生产工艺按原料可分为双氰胺法和尿素法两种，由于双氰胺法的成本较高，目前均采用尿素法生产。尿素在370～400℃高温下熔融沸腾、热分解为氰酸、异氰酸,氰酸类化合物在催化剂作用下进一步缩合形成三聚氰胺[C3N3(NH2)3][20－22]。三聚氰胺的制造工艺表明，其合成的物质条件必须具备有脲类、氰酸或氰胺类化合物的存在。

尿素是动物蛋白代谢的主要产物，水产饲料的主要原料——鱼粉等动物源性原料均含有尿素，也含有无机氨（或铵）、简单有机胺，还含有大分子的含氮化合物，如酰胺类、胍类、吲哚类、氨基氰等[15，23]。因此，水产饲料原料中三聚氰胺合成的物质条件已基本具备。水产饲料的造粒是一个加热、挤压、高速切剪的高温、高压过程，饲料在蒸汽和强烈挤压摩擦作用下，其体系温度迅速上升，过程温度可达150℃以上；在这种高温（130～180 ℃，或以上）、高压（1.5～10 MPa）、高湿、高切剪力状态下，淀粉颗粒破裂糊化、蛋白物质熔融，部分有机质物产生分解、聚合等美拉德（Maillard）反应[24]。饲料中的有机含氮化合物的分解与聚合，与脲类化合物形成三聚氰胺或许存在着可能。为探讨尿素是否是饲料在挤压造粒过程形成三聚氰胺的主要影响因素，我们进行了添加尿素的在线对比试验。

添加尿素的在线对比试验同样选择2类不同的挤压膨化机进行，单螺杆挤压机进行了两组不同原料的对比试验：①不含动物性饲料原料组(罗非鱼饲料)；②含有动物性饲料原料组(鳝鱼饲料，含20%进口鱼粉和15%国产鱼粉)。双螺杆挤压膨化机进行了含16%进口鱼粉和20%国产鱼粉的鲳鱼饲料造粒对比试验。对比试验均与不添加尿素在线生产的同类饲料对比试验为参照，结果见表5。

表5 添加尿素的水产饲料于挤压造粒前、后三聚氰胺含量对比(mg/kg)

从两组不同原料的对比试验结果可以看出，不含动物性原料组的罗非鱼饲料于膨化造粒过程中ΔCMA均值为0.0021 mg/kg，而添加了0.5%尿素的罗非鱼饲料组ΔCMA均值为0.0023 mg/kg，二组结果几乎没有差异。未加尿素的含动物源性原料组（鳝鱼饲料）膨化造粒过程的ΔCMA为0.0022 mg/kg；其添加0.5%尿素组的饲料ΔCMA=0.0036 mg/kg；在含35%鱼粉的饲料中添加0.5%尿素，其膨化造粒过程三聚氰胺平均增量也仅提高加了0.0014 mg/kg。双螺杆挤压膨化机进行的鲳鱼饲料造粒对比试验结果：未加尿素组ΔCMA均值为0.0158 mg/kg，添加0.5%尿素组ΔCMA均值为0.0322 mg/kg；两组对比的结果也仅提高了0.0164 mg/kg。添加尿素的饲料造粒对比试验结果表明：尿素在饲料挤压造粒过程中或许能够产生微量ΔCMA，但不可能是造成饲料中三聚氰胺超标的主要因素。

2.5 缩二脲对饲料造粒过程的三聚氰胺增量影响的试验

在协助厦门饲料生产企业对其膨化饲料产品中CMA屡次超标的原因进行排查与探讨过程中，我们发现均出现缩二脲类“蛋白精”的影子。

缩二脲(Biuret)，又名双缩脲、氨基甲酰脲,为无色针状晶体,分子结构式为 NH2－CO－NH－CO－NH2，分子质量103.08，与三聚氰胺一样均是尿素热缩合的产物。缩二脲在美国、日本、欧洲等国家和地区已批准为反刍动物非蛋白氮饲料添加剂，在反刍动物体内与尿素有相同的作用机制。与尿素相比,缩二脲的特点是水中溶解度低，在反刍动物瘤胃中释氨缓慢,解决了尿素释氨较快易产生氨中毒的问题,而且适口性和饲喂效果均有所提高[25－27]。我国于2005年颁布了《饲料级缩二脲》行业标准（NY/T 935—2005）,饲料级缩二脲定义为:“由尿素热缩合而生产的用作反刍动物非蛋白氮饲料的缩二脲”。其质量指标规定：缩二脲含量≥55%，总氮含量范围为35%～43%；其共存同系物的限量为:尿素≤15%、三聚氰酸和缩三脲等总量≤25%[28]。然而，缩二脲的高含氮量（相当于219%～269%蛋白质含氮量）及其饲料级的模糊界定被不法蛋白原料商所利用，由于直接添加尿素等水溶性含氮化合物容易被检出，缩二脲便成为后起的“蛋白精”之一。

饲料级缩二脲系采用以尿素为原料直接加热缩合生产的初级产物。固体尿素在160℃以上高温熔融、热分解并缩合形成缩二脲。由于反应过程的热量分布不均,易出现局部温度过高现象，故所生成的副产物也较多[29－30]。尿素受热分解成氰酸和氨，进而氰酸与尿素缩合生成缩二脲；缩二脲还可进一步与氰酸或尿素缩合，生成副产物三聚氰酸、缩三脲；氰酸也可能进一步缩合生成氨基氰、双氰胺或三聚氰胺[31]。因此，缩二脲初级产品的副产物中不仅含有一定含量的三聚氰酸、缩三脲，也不可避免地含有合成三聚氰胺的中间体——氰酸、氨基氰、双氰胺等化合物；甚至也可能有少量的三聚氰胺产生。而这些众多的含氮化合物很可能在饲料造粒过程的高温、高湿、挤压条件下进一步被缩合为三聚氰胺。

为探讨缩二脲是否成为颗粒饲料造粒过程产生三聚氰胺增量的主要影响因素，本项目组于2011年6月进行饲料中添加缩二脲的实验室模拟试验。模拟试验以牛蛙粉状配合饲料为底物，按1.2.5的方法步骤实施。饲料添加缩二脲的对比试验样品中三聚氰胺检测结果见表6。

表6 添加缩二脲的牛蛙饲料于在同试验温度的三聚氰胺含量(mg/kg)

从测定结果可以看出，加入0.5%缩二脲的饲料即使未经加热处理，其三聚氰胺背景值也有所提高，提高幅度似乎与缩二脲产品的纯度有关；本结果说明，缩二脲产品中确实存在三聚氰胺类副产物。加热对比试验结果表明，试验体系加热至100℃时，空白组与对比试验组三聚氰胺的增量均不明显；而到了150℃时，对比试验组ΔCMA迅速提高，其中以添加饲料级缩二脲组为最大（平均ΔCMA=1.02 mg/kg），添加化工级缩二脲组的平均ΔCMA也达0.54 mg/kg；空白组的三聚氰胺含量从未检出（＜0.05 mg/kg）提高到0.051～0.058 mg/kg。当试验体系的温度继续升至200℃时，三聚氰胺的增量更加迅速，CMA均达到150℃时的二倍左右。CMA仍然以添加饲料级缩二脲组为最大，与150℃试验样比较，其增加量均值达1.14 mg/kg；而添加化工级缩二脲组的增量相对较低，与其150℃试样比较平均增加量为0.58 mg/kg。空白组饲料的三聚氰胺含量与增量也增加了近一倍。本试验结果表明，饲料中添加饲料级缩二脲在高温条件下明显存在三聚氰胺的增量，增量幅度与体系温度相关；与缩二脲产品的纯度似乎存在着负相关关系。

饲料造粒过程的物料体系是处于高速剪切、挤压摩擦，水分不断从蒸汽中得到补充；而本模拟试验的物料是处于静止的受热状态，水分只有减少、无法得到补充，故模拟试验结果与饲料实际造粒过程必定存在明显差异。但是，从本模拟试验结果基本可以说明三个问题：

①在饲料原料中添加饲料级缩二脲，不但会提高饲料中三聚氰胺的残留背景值，而且会显著提高饲料造粒过程的三聚氰胺增量。非法添加“蛋白精”是饲料中三聚氰胺含量超标的主要因素。

②饲料造粒过程中三聚氰胺增量幅度与体系的温度有关，当造粒过程体系的温度＞150℃时，温度越高，三聚氰胺含量的增幅越大。饲料中若存在可形成三聚氰胺的含氮化合物时，温度越高，三聚氰胺含量的增幅越显著。

③由于饲料级缩二脲产品系尿素高温热缩合的初级产品，其共存的三聚氰酸等同系氮化物大量存在也将增加三聚氰胺对养殖动物的毒理作用[32-33]。

本试验的结果同时也说明了自2009年底以来，饲料产品中三聚氰胺含量急剧、普遍降低的内在原因。即：自2009年6月8日，国家农业部明令禁止在饲料中人为添加三聚氰胺后，又于2009年10月29日发布第1282号公告：废止《饲料级缩二脲》（NY/T935—2005）产品标准，停止缩二脲作为饲料添加剂生产和使用。自此之后，饲料原料及产品中的三聚氰胺含量发生了历史性的变化。

3 结论

对我国饲料原料、水产饲料产品中三聚氰胺含量背景值的调查及其变化趋势的研究中发现，自2009年国家对饲料中三聚氰胺问题的专项整治之后，饲料原料及产品中的三聚氰胺含量均发生了历史性的变化。绝大多数饲料原料能够符合FDA规定的限量（CMA＜0.25 mg/kg）标准。自2009年以来，水产颗粒饲料产品的CMA持续以2倍以上的速度递减；至2011年，颗粒饲料中CMA大多数低于0.25 mg/kg的低残留水平，未发现饲料中出现三聚氰胺含量超标的现象。

对粉状饲料与其颗粒饲料中CMA的对比，以及水产饲料造粒前后CMA的对比试验均表明：饲料于挤压造粒过程中存在着三聚氰胺的增量，且增量值的大小与其饲料原料中三聚氰胺的残留背景值密切相关。经过对饲料中形成ΔCMA主要影响因素的对比试验研究结果发现：尿素在饲料挤压造粒过程中或许能够产生微量三聚氰胺，但不可能是饲料造粒过程中ΔCMA大幅度提高、甚至引起三聚氰胺超标的主要因素。而形成饲料原料中CMA较大残留背景值、并引起饲料造粒过程中产生较大ΔCMA主要影响因素是由于饲料原料中非法添加缩二脲类“蛋白精”。本研究结果同时也说明了自2009年以来饲料原料及产品中三聚氰胺含量急剧且普遍降低的原因所在。

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