RNA干扰介导的FAS基因沉默抑制小鼠结肠癌细胞免疫逃逸的研究*

刘丹 汪涯雅 黄振倩

结肠癌是常见恶性肿瘤之一，晚期结肠癌预后差，Dukes C期的 5年生存率只有30%~60%，而Duckes D期的5年生存率更低至<5%，重要原因在于肿瘤生长早期即可通过局部浸润、侵袭淋巴管或毛细血管等方式向远处播散转移，肿瘤的免疫逃逸造成机体免疫系统无法正确识别、清除播散的肿瘤细胞，癌细胞聚集生长并诱导毛细血管增生，最终在肝脏、肺、前列腺及骨等脏器发展形成转移灶。研究证明机体内存在着完善的抗肿瘤免疫监视系统和抗肿瘤免疫应答。与此同时，肿瘤细胞也进化出了一系列机制逃避宿主的免疫监视和攻击，如共刺激分子表达缺陷，分泌可溶性免疫抑制物质等，这就是肿瘤细胞的免疫逃逸。FAS（APO-1/CD95）与FASL（Fasligand）属于肿瘤坏死因子（TNF）超家族，为细胞凋亡相关基因，其相互作用可诱导细胞凋亡（Apoptosis），从而维持机体发育和自身稳定所必需的细胞生理性死亡。该系统同时也是机体抗肿瘤免疫的重要组成部分。FAS抗原高表达于机体正常细胞表面，常见肿瘤如消化道肿瘤、肺癌、乳腺癌，均表现为低表达FAS抗原，而高表达FASL抗原。Greeneltch等[1]和Wajant等[2]研究证实肿瘤细胞借助过表达的FasL，通过Fas/FasL途径诱导抗肿瘤活性淋巴细胞凋亡，抑制肿瘤细胞周围的肿瘤特异性效应T细胞（CTL）、自然杀伤细胞（NK）以及肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），从而逃避机体的免疫识别和免疫攻击。

本研究构建RNA干扰分子载体转染Balb/c小鼠淋巴细胞，降低肿瘤特异性淋巴细胞Fas抗原的表达。采用同种异体淋巴细胞混合培养，观察不同实验组中淋巴细胞对结肠癌细胞的诱导凋亡作用的耐受状况，探讨通过阻断FAS表达，抑制结肠癌细胞通过Fas/FasL途径诱导的抗肿瘤淋巴细胞凋亡作用及其在抗肿瘤免疫中的意义。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 Bab/c小鼠脾淋巴细胞株及小鼠结肠癌细胞株（CT26）由暨南大学李伟教授惠赠。细胞株置于含10%BSA，100 u/ml青霉素，100 μg/ml链霉素的RMPI1640培养液中，于5% CO2，37 ℃环境下培养。

1.2 分子载体构建 根 据NCBI GenBank中小鼠Fas基因cDNA序列（序列号：NM_007987，按照siRNA序列设计原则，利用Ambion公司设计软件，选择2个靶位点设 计两对共四条60bp左右大小的DNA片段，靶位点为716bp-736bp和782bp-802bp，序列如下：第一对正链：5’-GATCCATAC ATCCCGAGAATTGCTTTCAAGAGAAGCAATTCTCGGGATGTAT TTTTTTGGAAA-3’；负链：5’-AGCTTTTCCAAAAAAATACAT CCCGAGAATTGCTTCTCTTGAAAGCAATTCTCGGGATGTATG-3’。第二对正链：5’-GATCCGCATCAAGGAGGGCAAGATATT CAAGAGATATCTTGCCCTCCTTGATGTTTTTTGGAAA-3’；负链：5’-AGCTTTTCCAAAAAACATCAAGGAGGGCAAGATAT CTCTTGAATATCTTGCCCTCCTTGATGCG-3’。由上海恒新公司合成引物并克隆至表达载体pSilencer3.0中，即构建成Fas基因dsRNA分子表达系统。构建完毕后转化受体菌，筛选鉴定挑选表达效率较高组作为研究工具。

1.3 细胞转染 制备的分子载体采用脂质体法转染小鼠淋巴细胞。转染48 h后，在培养状态下，用倒置荧光显微镜观察细胞生长状态及形态学改变。在镜下观察真核表达质粒中增强型绿色荧光蛋白（EGFP）在细胞内的表达情况并计算转染效率。

1.4 实验分组 取对数生长期的小鼠淋巴细胞105置于培养板中，根据研究需要将其分为3个组：（1）实验组：转染研究用质粒。（2）阴性对照组：转染空白质粒。（3）空白对照组：不做任何转染。

1.5 流式细胞术检测各组淋巴细胞FAS/FASL表达水平FITC标记兔抗鼠CD95（FAS）抗体及CD174（FASL）购自上海瑞齐生物科技有限公司。细胞培养10 d后经胰酶消化，离心收集制成细胞悬液，PBS液洗涤后加入分别上述抗体，4 ℃孵育30 min后以流式细胞仪（Becton Dickinson）检测FAS/FASL表达。

1.6 同种异体混合淋巴细胞肿瘤细胞培养实验 取转染对数生长期CT26细胞接种至6孔板，调整细胞数约5×104/孔。随后按细胞数5:1比例取不同组对数生长期淋巴细胞与CT26细胞共培养，72 h后达到检测条件。

1.7 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）比色法检测各组淋巴细胞增殖生长情况 以生理盐水制备终浓度为5 mg/ml的MTT溶液，胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至（5~10）×104/ml，接种至96孔培养板，5% CO2，37 ℃孵育48 h。每孔加入 10 μl MTT溶液（5 mg/ml，即 0.5% MTT），继续培养4 h后终止培养，吸弃孔内培养上清液。每孔加入150 μl二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min，使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

1.8 统计学处理 采用SPSS 11.0进行统计分析，计量资料以（s）表示，组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 流式细胞术检测不同时期各组淋巴细胞表达FAS/FASL抗原情况 在细胞培养+15 d分别取各组淋巴细胞，制备细胞悬液并以FITC标记的CD95（FAS）抗体及CD174（FASL）抗体孵育，流式细胞术检测其表面FAS、FASL表达。研究发现转染RNA干扰分子载体实验组淋巴细胞表面FAS（CD95）表达水平明显下降，与阴性对照组及空白对照组比较存在统计学差异（P<0.05或P<0.01），证实实验组淋巴细胞FAS抗原表达被RNA干扰载体抑制。FASL（CD174）表达阳性率与阴性对照组及空白对照组间无明显差异（P>0.05）。阴性对照组与空白对照组间FAS、FASL表达率无明显差异（P>0.05）。见表1、图1。

表1 各组淋巴细胞表面FAS、FASL表达阳性率分析

图1 各组淋巴细胞表面FAS、FASL表达阳性率

2.2 MTT法检测各组淋巴细胞生长情况 在细胞培养+5 d、+10 d、+15 d、+20 d分别取各组淋巴细胞经MTT比色法检测其吸光度值（OD），分析细胞生长增殖情况。研究发现转染RNA干扰分子载体实验组淋巴细胞在培养至+10 d以后其增殖速度明显快于阴性对照组（仅转染空白质粒）及空白对照组（未转染质粒）。+15 d及+20 d监测OD值与阴性对照组及空白对照组比较差异存在统计学意义（P<0.05或P<0.01），阴性对照组与空白对照组间细胞增殖速度无明显差异。见表2、图2。

表2 各组淋巴细胞在各时间点吸光度测量值（s）

表2 各组淋巴细胞在各时间点吸光度测量值（s）

*与阴性对照组及空白对照组比较，P<0.05；△与阴性对照组及空白对照组比较，P<0.01

实验组 1.40±0.15 2.89±0.24 5.60±1.41*10.17±2.53*△阴性对照组 1.29±0.27 1.80±0.64 3.21±0.72 5.16±1.03空白对照组 1.24±0.13 1.38±0.39 2.19±0.95 4.29±1.69

图2 各组CT26细胞的生长曲线

3 讨论

Fas/FasL系统是细胞凋亡的重要信号传导系统之一，它既是机体重要的抗肿瘤免疫效应机制，也是肿瘤细胞诱发免疫逃逸的重要作用位点。目前关于Fas/FasL系统与肿瘤免疫逃逸的关系的研究主要集中于评价肿瘤细胞Fas抗原表达的下降和（或）FasL表达的增加在免疫逃逸中的地位和作用以及参与肿瘤细胞免疫逃逸的机制。目前认为Fas/FasL系统是结肠肿瘤细胞逃避宿主免疫监视或免疫杀伤的主要机制。Petak等[3]报道发现结肠癌组织可通过Fas基因突变来改变Fas启动凋亡的传递途径和干扰凋亡信号的传导，降低结肠癌细胞对T淋巴细胞FasL的敏感性，可能的机制：（1）凋亡抑制基因的高表达，如bcl-2和FAP-1。（2）血清sFasL（soluable Fas）水平升高，sFas区别于Fas之处在于，sFas分子跨膜区有363个bp缺失，使sFas分子跨膜区的17个氨基酸和膜外区5个氨基酸丢失，由于翻译产物缺乏跨膜区而呈可溶性分泌，结肠癌细胞分泌的sFas 与淋巴细胞表面的FasL结合可竞争性抑制结肠癌细胞与淋巴细胞表面的FasL结合，通过此途径抑制Fas介导的细胞凋亡。（3）产生FADD样的FLICE的抑制蛋白（FKIP）。（4）凋亡抑制因子家族成员上调。Fas基因改变导致Fas表达下调，使Fas介导细胞凋亡功能丧失，从而阻止结肠癌细胞凋亡。Song等[4]报道证实结肠肿瘤患者外周血存在高浓度、高效价的可溶性FasL（sFasL）分子，参与对结肠肿瘤患者全身免疫系统的抑制作用和组织损伤过程。该研究证实结肠肿瘤细胞在进入循环系统时产生和释放sFasL可使表达Fas抗原的细胞凋亡，也可以诱导激活T细胞的凋亡，使肿瘤细胞更易增殖并转移。今年来的文献报道抗FAS单克隆抗体（CH11）在结肠癌、乳腺癌、急性白血病等多种肿瘤的体外实验中已经被证实能够有效降低细胞膜FAS水平[5-6]，可以明显抑制肿瘤特异性免疫细胞的凋亡[7]，本次研究证实以RNA干扰技术沉默淋巴细胞FAS基因表达，可以明显减少细胞膜FAS抗原表达，从而封闭结肠癌细胞通过FAS/FASL对淋巴细胞的诱导凋亡作用，为抗肿瘤免疫效应研究提供了有价值的实验资料，并可为结肠肿瘤的生物治疗提供新的技术途径。

[1]Greeneltch K M，Schneider M，Steinberg S M，et al.Host immunosurveillance controls tumor growth via IFN regulatory factor-8 dependent mechanisms[J].Cancer Res，2007，67（21）:10406-10416.

[2]Wajant H.CD95L/FasL and TRAIL in tumour surveillance and cancer therapy[J].Cancer Treat Res，2006，130（1）:141-165.

[3]Petak I，Tillman D M，Harwood F G，et al.Fas dependent and independent mechanisms of cell death following DNA damage inhuman colon carcinoma cells[J].Cancer Res，2000，60（10）:2643-2650.

[4]Song E，Chen J，Ouyang N，et al.Soluble Fas ligand released by colon adenocarcinoma cells induces host lymphocyte apoptosis:an active mode of immune evasion in colon cancer[J].Br J Cancer，2001，85（7）:1047-1054.

[5]Mody M，Dharker N，Bloomston M，et al.Rosiglitazone sensitizes MDA-MB-231 breast cancer cells to anti-tumour effects of tumour necrosis factor-alpha，CH11 and CYC202[J].Endocr Relat Cancer，2007，14（2）:305-315.

[6]Chen J，Zhang H，Su F，et al.Cytokine associated sensitivity of colon carcinoma cells to FasR-mediated cytotoxicity of CTL[J].Asian J Surg，2002，25（1）:89-97.

[7]Iorns E，Lord C J，Turner N，et al.Utilizing RNA interference to enhance cancer drug discovery[J].Nat Rev Drug Discov，2007，6（7）:556-568.