蒙药银朱体外溶出实验可溶性汞含量的测定

苗培福 张瑞霞

(2.内蒙古乌海市蒙中医院，内蒙古 乌海016000)

安全性、有效性和质量可靠性是药品属性的三个基本要素，蒙药也不例外。蒙药是我国的传统用药，摄入汞剂量稍大或长期少量摄入在体内蓄积到一定程度均可引起中毒，损害肾脏、中枢神经系统、消化系统以及泌尿系统〔1〕。近年来，药汞含量超标问题已引起国内外的关注，为实现蒙药现代化，并且使蒙药走向国际市场，就必须强化对蒙药中可溶性汞含量的测定和分析〔2〕。

银朱最早载于《本草纲目》，它是人工制成的赤色硫化汞(HgS)，尚含有微量铅(Pb)、铜(Cu)、钠(Na)、铁(Fe)、铝(Al)等杂质。其味辛，性温，有毒。具有:攻毒、杀虫、燥湿、劫痰，等功效。银朱为许多蒙药成方所应用，例如清肺十八味丸。

蒙药使用的黑辰砂非天然产物，是按1:1比例硫磺炮制银朱(汞)，在铁锅内用煤炉加热至200～300℃左右反复搅拌形成黑灰色为止，其主要成分是硫化汞，它是蒙药复方制剂常用药材，具有镇惊、清热、收敛、破痈等作用，在44%蒙药水丸剂中配伍使用〔13〕。

银朱、黑辰砂中的硫化汞是一种较为稳定的汞盐，溶度积为9.3×10～53，在水中几乎不溶，是一种极难溶的化合物，与其它含汞化合物相比，毒性较低〔4－5〕。动物实验表明，银朱口服后，其中的汞可经胃肠道吸收，且吸收量远大于按溶度积计算的理论值。有文献报道，银朱中的硫化汞是不被机体吸收的无活性成分(约占给药量的98%)，而且有活/毒性成分为可溶性汞部分〔6〕。因此本实验模拟胃肠道实际情况，系统的比较人工胃液、人工肠液中胃蛋白酶、胰蛋白酶及硫化物对汞溶出的影响，用双硫腙分光光度法测定银朱、黑辰砂、纳米银朱及蒙药成方清肺十八味丸在不同化学体系中可溶性汞的含量，初步研究可能被人体吸收的汞的含量，从而为建立银朱及含银朱蒙药的质量控制标准和临床用药的安全合理性提供依据〔7－8－9〕。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

RC806溶出试验仪(天大天发);WFJ7200型可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司);FA214电子天平(上海海康电子仪器厂);DGG－9240B型智能鼓风干燥箱(杭州卓驰仪器有限公司);H1850台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)。

1.2 试剂

胃蛋白酶，胰蛋白酶硫，双硫腙，盐酸羟胺，乙二胺四乙酸二钠，氯仿，氨水，高锰酸钾，盐酸，硫酸，硝酸，氢氧化钠，磷酸二氢钾等均为分析纯。

1.3 药品

银朱(湖南省湘潭市滴水化工厂);黑辰砂(内蒙古呼和浩特市蒙药研究所);纳米银朱(内蒙古医学院无机化学专题室合成);清肺十八味丸(内蒙古蒙药股份有限公司);硝酸汞。

2 实验方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 0.65%(m/V)双硫腙氯仿贮备液:称取 0.65g双硫腙溶于100mL三氯甲烷，贮于棕色瓶中，存于暗处。

2.1.2 0.026%(m/V)双硫腙工作液:吸取2ml双硫腙贮备液于分液漏斗中，加入2%氨水50mL，振摇萃取，弃去有机相，水相提取液过滤后即得。此液需在临用时配制。

2.1.3 汞标准贮备液:称取在硫酸铜干燥器中放置过夜的0.1646g硝酸汞，用去离子水溶解后，转移至100mL容量瓶中，再用去离子水稀释至标线，摇匀。此溶液每毫升含0.9897mg汞。

2.1.4 汞标准使用溶液:吸取汞标准贮备液1.00mL，注入100mL容量瓶，用1%硝酸溶液稀释至标线，摇匀。此溶液每毫升含9.897μg汞。

2.1.5 人工胃液:用去离子水稀释13mol·L－1HCl至pH=1.50，现配现用。

2.1.6 胃蛋白酶液:称取1.6g胃蛋白酶溶于10mL0.1mol·L－1HCl，配制成质量浓度为 0.16g·mL－1胃蛋白酶液，现配现用。

2.1.7 人工肠液:称取 KH2PO46.8g，加去离子水500mL溶解，用 0.1mol·L－1NaOH 水溶液调节 pH 值至 6.8，现配现用。

2.1.8 胰蛋白酶液:称取0.180g胰蛋白酶溶于45mL人工肠液，配制成胰蛋白酶质量浓度为0.004g·mL－1的胰蛋白酶液，现配现用。

2.1.9 含硫人工肠液:称取每份样品质量三分之一的硫粉溶于已配制的人工肠液中，现配现用。

2.1.1010 %(m/V)EDTA溶液:将10g分析纯乙二胺四乙酸二钠用去离子水溶解并稀释至100ml。

2.1.11 6mol/L NaOH溶液:将24g分析纯氢氧化钠用去离子水溶解并稀释至100mL。

2.1.12 5%(m/V)KMnO4溶液:将5g分析纯高锰酸钾用去离子水溶解并稀释至100mL。

2.1.13 10%(m/V)盐酸羟胺溶液:将10g分析纯盐酸羟胺用去离子水溶解并稀释至100mL。

2.2 标准曲线的制备

于 8个 50ml容量瓶中，分别加入 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00mL 的汞标准使用液，每个容量瓶中加入10mL10%(m/V)EDTA溶液，摇匀后加入 8ml 6mol/L NaOH溶液，摇匀后加入2mL 0.026%(m/V)双硫腙工作液，用去离子水稀释至标线，摇匀，于551nm波长处测定吸光度。以试剂空白为参比，于551nm波长处测定吸光度。

表1 汞标准曲线数据

回归方程:在0.2～1.6(?μ/ml)范围内线性关系为:A=0.2955c+0.0127，r=1.0442.

2.3 银朱、黑辰砂、纳米银朱、清肺十八味丸、硝酸汞的溶出

准确称取银朱、黑辰砂、纳米银朱、清肺十八味丸，硝酸汞一定量 (均做3个平行样)，与不同溶出液500ml混合，将放于37℃，100r·min－1振摇，人工胃液、胃蛋白酶液中2h，人工肠液、胰蛋白酶液、含硫人工肠液中8h。再在室温下，5000r·min－1离心10min，取上清液(除胃蛋白酶液组和胰蛋白酶液组)，待测;胃蛋白酶液组和胰蛋白酶液组则是先静置至溶液分3层，将上清液和下层沉淀弃去，取中层含絮状沉淀的溶出液，在室温下，5000r·min－1离心10min，取上清液，待测。

为研究pH、蛋白质以及硫化物的影响，溶出液分别为用盐酸和磷酸盐缓冲液配制的不同pH的溶液，含不同蛋白质胃蛋白酶(pepsin)，胰蛋白酶(trypsin)的溶液及一定浓度的含硫人工肠液。

2.4 可溶性汞含量的测定

分别吸取25.00ml溶出液(除硝酸汞组)于50ml容量瓶中，依次加入10%(m/V)EDTA 10.00ml，6mol/L NaOH 8.00mL，0.026%(m/V)双硫腙工作液 2.00mL，用去离子水稀释至标线。以相应的试剂空白为参比，在551nm波长下测定吸光度。结果见表2、表3。

表2 胃液、胃蛋白酶液中药品溶出数据

表3 肠液、胰蛋白酶液、含硫肠液中药品溶出数据

3 讨论

3.1 pH对汞溶出的影响

试验结果(见表4)表明，pH对银朱、黑辰砂、纳米银朱和清肺十八味丸中汞的溶出量有较大的影响，随着 pH的降低，汞的溶出量明显增加。人工胃液中(pH=1.5)汞的溶出量明显大于人工肠液(pH=6.8)。这可能是由于银朱矿物中含有了其他形式的汞化合物杂质而造成的。

表4 人工胃液和人工肠液汞溶出量比较

3.2 胃蛋白酶和胰蛋白酶对汞溶出的影响

在消化道存在胃蛋白酶和胰蛋白酶，这些物质特别是含巯基的物质对于汞均有结合能力。因此本试验研究了胃蛋白酶和胰蛋白酶对银朱、黑辰砂、纳米银朱和清肺十八味丸中汞的溶出量的影响，试验结果(见表5)表明，胃蛋白酶和胰蛋白酶对汞溶出量有一定的促进作用，但是不够明显。

3.3 硫对汞溶出的影响

由于肠内经细菌代谢后会产生硫化物，而HgS具有与硫形成多硫化物的性质，所以本试验研究了人工肠液中加入硫粉对汞溶出的影响。试验结果(见表6)表明，人工肠液中加入硫粉对银朱、黑辰砂、纳米银朱和清肺十八味丸中汞的溶出有较强的助溶作用。

表5 人工胃液和人工肠液加酶前后汞溶出量比较

表6 人工肠液和加硫人工肠液汞溶出量比较

在人体肠道内存在形成汞多硫化物的条件，包括弱碱性环境和肠内细菌分解所产生的大量 H2S(主要以 HS－的形式存在)。因此可以推测，多硫化汞配合物可能是银朱在体内的一种重要形式。

3.4 溶出液中微粒的存在和粒度分布对汞溶出的影响

为观察HgS溶出的形式是可溶性物质还是悬浮微粒，分别对银朱和纳米银朱在人工胃液、胃蛋白酶液、人工肠液、胰蛋白酶液和含硫人工肠液进行溶出试验，试验结果(见表7)表明，含硫人工肠液对纳米银朱中汞溶出的影响显著，汞的溶出量约为银朱中的15倍。

表7 银朱和纳米银朱汞溶出量比较

4 结论

通过比较胃肠道中存在的各种化学因素对银朱、黑辰砂、纳米银朱、清肺十八味丸中汞溶出的影响，得结果为pH对汞溶出量有较大的影响，蛋白质的促溶作用有限，硫对汞溶出量的影响显著高于其他，纳米银朱对含硫人工肠液中汞溶出的影响显著。提示银朱在肠道中的形式可能为汞的各种含硫配合物;至于汞的含硫配合物能否在肠道中吸收并发挥药理作用还有待进一步去证实。

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