热稳定酸性β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

陈今朝，王剑锋*，王慧超，谭永忠

(1.长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 408100；2东华理工大学生物系，江西 抚州 344000)

热稳定酸性β-葡萄糖苷酶的分离纯化及其酶学性质

陈今朝1，王剑锋2,*，王慧超1，谭永忠1

(1.长江师范学院生命科学与技术学院，重庆 408100；2东华理工大学生物系，江西 抚州 344000)

耐酸性黑曲霉菌株Aspergillus niger L.的菌丝体破碎液依次经过乙醇沉淀、离子交换层析和凝胶过滤等步骤处理，获得电泳纯的β-葡萄糖苷酶，SDS-PAGE显示其分子质量为125.7kD。β-葡萄糖苷酶水解对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷的最适pH值为3.0～4.0，最适温度为70℃，表观米氏常数(Km)值为2.35mmol/L，表观kcat/Km值为2.99×104L/(mol·s)；水解京尼平苷、水杨苷的表观kcat/Km值分别是1.26×104、1.37×104L/(mol·s)；水解活性受Mn2+的显著激活和Fe2+、Zn2+、Cu2+等离子的微弱抑制。该酶活性在pH2.0～8.3保持稳定；酶在65℃时保温60min，残余酶活达到了85%，是一种热稳定酸性β-葡萄糖苷酶。

胞内酶；乙醇沉淀；对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷；京尼平苷；β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BGL，EC 3.2.1.21)是纤维素完全酶解糖化的限速酶种[1]；具有水解和糖基转移活性，底物专一性较差，对多种糖苷类物质均有较强的催化活性[2]。因而，BGL在纤维素生物炼制和药食资源开发利用等领域具有广泛的应用价值，如用于低聚龙胆糖的生产[3]、红景天苷等糖苷类活性物质的酶法合成[4-5]和转化天然产物中的糖苷类物质[6]，从而改善和提高果蔬茶的风味及中草药的药理活性。黑曲霉是常见的BGL产酶菌种，也是食药生产领域公认的安全菌株。本实验室从霉烂的栀子果上分离到一株能水解京尼平苷的黑曲霉菌株Aspergillus niger L.，该菌株具有较强的耐酸性，在培养基初始pH1.5时，仍能正常产酶；该菌株可以产生两种胞外酸性BGL，它们的最适反应pH值均为2.5，其他酶学性质也显著区别于他种菌株来源的BGL[7]。本实验对Aspergillus niger L. 菌丝进行了破碎抽提，从中制备了一种电泳纯的BGL，并对其酶学性质进行了实验分析，为进一步开发利用Aspergillus niger L.源BGL提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

黑曲霉Aspergillus niger L.为实验室分离自霉变栀子果。

DEAE-Sepharose FF、Sephadex G-100 美国Pharmacia公司；蛋白质分子量标准 上海生工生物工程技术服务有限公司；考马斯亮蓝R-250、聚乙二醇20000(PEG-20000)、对硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)、3,5-二硝基水杨酸(DNS) 国药集团化学试剂有限公司；其余化学试剂均为分析纯。

UV-1600紫外-可见分光光度计 北京瑞利分析仪器公司；QT-2H自动液相色谱分离层析仪(配有N2000色谱数据工作站) 上海琪特分析仪器有限公司；DYCZ-3 型电泳槽、DYY-4C 型电泳仪 北京六一仪器厂；GL-21MC立式冷冻离心机 湘仪离心机仪器有限公司；JYD-900超声波细胞破碎机 上海之信仪器有限公司。

1.2 BGL的制备与分离

1.2.1 BGL的制备

Aspergillus niger L.孢子接种在豆渣培养基中28℃、180r/min培养5d；发酵醪液经丝网过滤收集菌丝体，菌丝体用蒸馏水洗涤多次并压干水分，然后将菌丝体分散在适量pH8.0、100mmol/L Tris-HCl缓冲液中进行超声破碎，超声功率800W、时间20min、破碎3s、暂停3s，后将菌丝破碎液于12000r/min离心15min，上清液即为粗酶液。

1.2.2 BGL的分离

取一定体积冷藏粗酶液，加入1.25倍体积-20℃乙醇混匀，冷冻离心得沉淀；沉淀以少量pH7.5、20mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液溶解，上柱DEAE-Sepharose FF、洗柱至基线平直，用同样缓冲液配制的0～0.4mol/L NaCl溶液400mL线性梯度洗脱，洗脱流速90mL/h，每5.0mL收集一管，检测与280nm波长处光吸收峰相对应各管的酶活力和纯度。收集各管酶液于透析袋中并用PEG-20000包埋浓缩；浓缩酶液进行凝胶过滤Sephadex G-100，pH7.5、20mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液洗脱，流速10mL/h，每3.0mL收集一管，检测蛋白峰各管酶活力。

1.3 指标的测定

1.3.1 蛋白质浓度的测定

依据Bradford法[8]测定蛋白质浓度。

1.3.2 SDS-PAGE[9]

SDS-PAGE条件：浓缩胶4%、分离胶10%，染色剂：考马斯亮蓝R-250。

1.3.3 BGL活性的测定[7]

采用pNPG法和DNS法分别测定BGL的活性。

1.3.4 酶的最适反应温度及热稳定性的测定

在不同温度下pNPG法测定酶活力，以酶活力最高时的反应温度为最适反应温度；酶液在不同温度下分别水浴保温20、40、60min后测定酶活力，以未保温酶液的酶活力为100%，比较不同温度条件下的相对酶活力。

1.3.5 酶的最适反应pH值及pH值稳定性的测定

在不同pH值的缓冲液中按照pNPG法测定酶活力，以酶活最高时的反应pH值为最适反应pH值；将酶液用不同pH值的缓冲液同等倍数稀释，25℃水浴保温12h，测定相对酶活力。

1.3.6 无机离子对酶活力的影响

在含待考察离子10mmol/L的酶促反应体系中以pNPG为底物测定酶活力，以去离子水透析的酶液的酶活力为100%。

1.3.7 酶促动力学参数测定

在65℃、pH4.0、100mmol/L 醋酸-醋酸钠缓冲液中酶液与不同浓度底物反应，用Linewear-Burk作图法求出酶水解底物的米氏常数(Km)、最大反应速率(Vmax)，测定酶蛋白量计算酶的底物转换数(kcat)。

1.4 数据分析

采用统计软件DPS v3.01专业版，SSR检验显著性水平α＝0.05。

2 结果与分析

2.1 Aspergillus niger L.胞内β-葡萄糖苷酶的分离与纯化

图1 β-葡萄糖苷酶的SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE of BGL from Aspergillus niger L.

菌丝体经超声破碎抽提获得BGL75.2U/g(以菌丝干质量计)。粗酶液分别用PEG-6000(20mg/100mL)、(NH4)2SO490%饱和度沉淀浓缩，酶活回收率分别为14%和81%，显示胞内BGL与胞外BGL在溶解性上存在显著差异。粗酶液依次经过乙醇沉淀、D EA E-Seph arose FF、Sephadex G-100柱层析(表1)，获得了电泳纯的BGL，SDS-PAGE图谱(图1)显示BGL的分子质量为125.7kD。

表1 β-葡萄糖苷酶的分离纯化Table 1 Purification of BGL from Aspergillus niger L.

2.2 Aspergillus niger L.胞内BGL的酶学性质

2.2.1 pH值对BGL活性及稳定性的影响

图2 pH值对β-葡萄糖苷酶活性及稳定性的影响Fig.2 Effect of pH on BGL activity

由图2可知，在pH值2.0～6.5的范围内，BGL对pNPG均有明显的水解活性，其中pH值为3.0～4.0时，酶的水解活性最高；此外，酶的水解活性随pH值变化而下降，pH值由3.0下降至2.0时，酶活下降了66%，而pH值由4.0上升至5.0时，酶活下降了30%，说明在较低的pH值范围内，酶活力对酸度的变化更明显。25℃保温12h后，BGL残余酶活力在pH2.0～8.3的范围内稳定，说明胞内BGL具有很好的pH值稳定性。

2.2.2 温度对BGL活性及稳定性的影响

图3 温度对β-葡萄糖苷酶活性的影响Fig.3 Effect of temperature on BGL activity

图4 β-葡萄糖苷酶的热稳定性Fig.4 Combined effects of temperature and incubation time on BGL stability

表2 金属离子对β-葡萄糖苷酶活性的影响Table 2 Effects of inorganic ions on BGL activity as tested using pNPG as substrate

由图3可知，BGL在30～80℃均有水解活性，最适作用温度为70℃，但反应温度高于70℃时，相对酶活力急剧下降，80℃时的反应活性与30℃时的活性相当。由图4可知，在65℃保温60min，相对酶活力为85%，而在70℃保温60min，相对酶活力仅为14%，因此，胞内BGL有较好的热稳定性。

2.2.3 金属离子对BGL活性的影响

由表2可知，BGL水解pNPG的活性受不同金属离子(10mmol/L)的影响。Mn2+、Fe3+、Ba2+、Mg2+、Na+、Hg+等离子激活BGL水解活性，其中以Mn2+的作用最为显著；Cu2+、Zn2+、Fe2+等抑制酶活性，Fe2+的抑制作用较明显；K+和Ca2+对酶活性则无明显影响。

2.2.4 BGL的底物特异性及催化效率

在pH4.0、65℃的反应条件下，依据Linewear-Burk作图法分别以pNPG、京尼平苷、水杨苷为底物测定BGL的Km、kcat(表3)。依专一性常数kcat/Km可知，胞内BGL水解pNPG的催化效率是京尼平苷、水杨苷的两倍多，而水解后两者的催化效率相当，因此，pNPG是胞内BGL的最适底物；同时也说明BGL对β-葡萄糖苷的苷元物质具有选择性。

表3 β-葡萄糖苷酶的动力学参数Table 3 Km and kcat values of BGL for three specific substrates

3 讨 论

微生物源BGL的分子质量、酶学性质因菌种、菌株不同而有较大差异，其适用范围也随之不同。BGL的分子质量一般介于40～250kD，多数在70～138kD；最适反应pH值为3.5～7.0，以pH4.0～6.0常见；pH值稳定范围多在pH4.0～8.0；最适反应温度常为55℃，部分为65～70℃；热稳定范围常小于60℃[1,10-22]。Aspergillus niger L.株胞内BGL的分子质量为125.7kD，最适反应温度、pH值分别为70℃、3.0～4.0，pH值稳定范围为pH2.0～8.3，65℃保温60min，相对酶活力保留85%，除分子质量与Aspergillus niger NL-1胞内BGL(122.7kD)[14]接近外，最适反应温度、pH值、pH值稳定范围和热稳定温度均明显不同于后者(60℃、5.0、3.0～6.0、60℃)，也区别于实验菌株产生的胞外BGL(55℃、2.5、2.0～7.0，55～60℃)[7]；因此，该酶是一种耐酸耐热的BGL，它的分子质量和最适反应pH值与Penicillium pinophilum[11]Penicillium purpurogenum[16]等来源的BGL相近，最适反应温度与Penicillium decumbens[1]、 Penicillium citrinum[19]、Periconia sp.[20]、Fomitopsis palustris[22]等来源的BGL相同，热稳定性优于Termitomyces clypeatus来源的BGL(60℃保温1h，残余酶活80%)[13]，而不及Periconia sp.来源的BGL(70℃保温1.5h，残余酶活60%)[20]。

BGL的水解专一性较差，能作用于所有的葡萄糖β-二聚物；作用于β-1,4、β-1,1、β-1,2、β-1,3和β-1,6连键；裂解C-O糖苷键、C-S键、C-N键和C-F键等；有些能水解β-葡萄糖苷、β-半乳糖苷，甚至木糖苷[2]。实验菌株胞内BGL对邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、对硝基苯-α-D-吡喃半乳糖苷无水解活性，区别于其胞外BGL，说明该酶底物专一性高于胞外BGL，对底物的糖苷键构型和糖基种类均具有选择性。底物专一性常数kcat/Km显示，该BGL对pNPG、水杨苷和京尼平苷等β-D-吡喃葡萄糖苷均有催化活性，pNPG是其天然底物，水解京尼平苷和水杨苷的催化效率相当且远低于pNPG，表明胞内BGL的催化效率受底物分子中苷元结构的影响，而胞外两种BGL的天然底物是京尼平苷，其对京尼平苷的催化效率(kcat/Km分别为4.28×104L/(mol·s)和1.04×105L/(mol·s))[7]也远高于胞内BGL；并且胞内BGL对pNPG的催化效率高于未培养源BGL1T[12]和源于Penicillium citrinum的嗜酸热BGL[19]。胞内BGL的催化活性也受金属离子的明显影响，受Mn2+的显著激活，受Fe2+、Zn2+、Cu2+等的抑制，但受抑制强度显著弱于胞外BGL1。

Aspergillus niger L. 菌株胞内BGL具有耐酸耐热、专一性较强、催化活性高且受金属离子影响小等特点，其酶学性质显著优于他种来源的β-葡萄糖苷酶，适用于橙汁脱苦、中草药活性成分转化、纤维素酶解糖化等酸性高温的工业应用环境。

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Purification and Characterization of Thermostable Acidic β-Glucosidase from Aspergillus niger L.

CHEN Jin-zhao1，WANG Jian-feng2,*，WANG Hui-chao1，TAN Yong-zhong1
(1. Life Science and Technology Institute, Yangtze Normal University, Chongqing 408100, China ；2. Department of Biology, East China Institute of Technology, Fuzhou 344000, China)

In this study, an acidic β-glucosidase (BGL) was purified from acid-tolerant Aspergillus niger L. mycelia by ethanol precipitation, DEAE-Sepharose column chromatography and Sephadex G-100 column chromatography. SDS-PAGE showed that the molecular weight of the enzyme was 125.7 kD. Further characterization revealed that it had maximal hydrolytic activity on p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG) at pH 3.0 — 4.0 and 70 ℃ with a Kmof 2.35 mmol/L and a kcat/Kmof 2.99 × 104mol/L·s. The kcat/Km values for hydrolyzing geniposide and salicin were 1.26 × 104L/(mol·s) and 1.37 × 104L/(mol·s), respectively. The hydrolytic activity was activated obviously by Mn2+but inhibited faintly by Fe2+, Zn2+and Cu2+. The BGL was highly stable at pH 2.0 — 8.5, and 85% of its original activity could be maintained after 60 min of heat treatment at 65 ℃. Thus, the enzyme was highly stable to heat.

intracellular enzyme；ethanol precipitation；p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside；genipin；βglucosidase

Q939.97

A

1002-6630(2012)11-0205-05

2011-06-03

重庆市科技攻关计划项目(CSTC，2011AC1004)

陈今朝(1964—)，男，副教授，硕士，研究方向为微生物工程。E-mail：chenjinzhao@126.com

*通信作者：王剑锋(1968—)，男，讲师，硕士，研究方向为微生物工程。E-mail：wangjianfeng68@126.com