江青东,王慧杰
(郑州牧业工程高等专科学校继续教育学院,河南 郑州450011)
5-羟色胺(5-HT)是一种吲哚衍生物,分子式C10H12N2O。5-HT在脑组织中的浓度较高,它是调节神经活动的一种重要物质[1-4]。同时美国辛辛那提大学医学院的纳尔逊·霍斯曼和其他研究人员发现,5-羟色胺会发出一种信号,降低奶牛的产奶量。只要抑制奶牛乳腺中的5-HT含量,就可以将产奶量提高15%。其机理是乳腺上皮合成的5-HT抑制了催乳素(PRL),对乳腺的刺激,影响乳腺的发育和泌乳,抑制PRL刺激的乳蛋白基因表达,提示是经过 5-HT 受 体 产 生 的[5-7]。 目 前,哺 乳 动 物 5-HTR基因在乳腺组织中的分布尚未有报道,本试验通过RT-PCR技术克隆了奶山羊乳腺组织中5-HTR1基因,为进一步研究5-HT在其受体的作用下对哺乳动物牛的乳腺发育和调控泌乳方面提供理论基础。
1.1 试验动物及样品采集 取泌乳期奶山羊(购自陕西萨能奶山羊养殖基地)乳腺组织,入液氮速冻,置-80℃保存,待测。
1.2 酶与试 剂 AMV 反转 录 酶、RNase-Inhibitor、Oligo(dT)、Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、Buffer、DNA Marker、pMD-19T 载 体、TaKaRa Agarose Gel、DNA Purification Kit Ver.2.0、E.coli JM109感受态细胞、T4DNA连接酶等,均购自上海生工生物工程技术服务有限公司;动物组织RNAout(Sigma)。
1.3 PCR引物的设计及合成 根据GenBank公布的牛和鼠的5-HTR1基因的同源序列,利用Primer5.0引物设计软件和BLAST鉴定设计1对克 隆 引 物。 上 游:5′-TGGTGATGCCCTTCAGCATTGTGTATA TTGT-3′,下游:5′-GGAAGCCAACATATTACAAATGCACCCAAG-3′,预期片段680bp,引物由北京三博远志生物科学技术有限公司合成。
1.4 奶山羊乳腺组织总RNA的提取及含量测定按照动物组织RNAout试剂盒的说明书进行提取乳腺组织总RNA:0.8%琼脂糖凝胶电泳(130V,
15min),紫外灯下观察,检查其完整性。核酸分析仪测定OD260和OD280,检测RNA的纯度及含量。
图1 乳腺组织中总RNA电泳结果
1.5 RT-PCR法 cDNA合成体系 模板RNA 2 μL,5×Buffer 4μL,dNTP Mix(2.5mmol/L)4 μL,RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL,Oligo(dT)18(50pmol/L)1μL,AMV(5U/μL)0.5μL,DEPC-H2O 6μL,总体积20μL。混匀,室温放置10min,入42℃1h,置-20℃冰箱备用。PCR扩增体系:10×Buffer(Mg2+)5μL,dNTP Mix(2.5 mmol/L)6μL,25mmol/L MgCl26μL,r Taq (5 U/μL)0.5μL,上、下游引物(20pmol/L)各1μL,cDNA 4μL,ddH2O 14μL,总体积50μL。PCR反应程序 :95℃变性5min;95℃10s,52℃20s,72℃30s,共35个循环;最后72℃延伸10min。反应完成,分别取5μL PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶、100 V、30min电泳。凝胶成像系统照像并检测PCR产物积分光密度(IOD)值,用各基因与β-actin的比值相对定量转录水平。
1.5.1 PCR产物回收 目的片段的回收参照上海生工生物工程技术服务有限公司UNIQ-10胶回收试剂盒说明书进行。
1.5.2 目的基因的克隆与测序 将PCR扩增产物纯化后,与pMD-19T载体连接,构建克隆载体。转化到JM109感受态细胞,进行蓝白斑筛选,重组质粒通过酶切和PCR鉴定:1%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果;阳性菌液送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
1.6 序列分析 利用BioXM 2.6、DNAStar软件及Blast、Smart进行分析。
2.1 RT-PCR扩增及克隆 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,得到了长度为680bp的目的片段(图2)。菌落PCR鉴定得到同样大小的目的片段(图3)。
2.2 奶山羊5-HTR1基因的克隆序列 测序结果及推测的氨基酸序列如图4。克隆的奶山羊5-HTR1基因包含一个完整的开放阅读框架(open reading frame,ORF),长为680bp,分子量为110.29 kDa,其中酸性氨基酸为45个,碱性氨基酸为56个,等电点为4.77。
2.3 奶山羊5-HTR1基因的种属差异分析
DNAStar分析发现,奶山羊5-HTR1基因的ORF与人 (NM-000866)、鼠 (NM-021857)和 牛 (NM-001206605)同源性分别为73.3%、82.1%、93.2%。Blast序列比较分析,奶山羊5-HTR1氨基酸序列与牛和鼠的同源性分别为91%和81%,相似性分别为87%和81%;Smart分析发现,奶山羊5-HTR1基因推测氨基酸序列信号肽与牛、鼠5-HTR1氨基酸序列信号肽均为1~45aa,SapB结构域均为78~145aa,结构特征与牛、鼠的5-HTR1结构特征相一致。
5-HT分布全身,尤其在血小板和肠内更多,脑内主要是在中缝核及延脑中。迄今为止已发现人类5-HT受体至少有7大类,这7种类型又可进一步分成若干亚型[8-11]。按照受体转导方式的不同,可分为G蛋白偶联体超家族和配体门控离子通道族两大类。5-HTR1主要分布于基底节及新皮层区,周围组织血管及神经节中也有分布[12]。目前5-HTR激动剂和抑制剂都是用于神经系统的药物,治疗精神疾病[13]。况且没有专门针对5-HTR的药物,将这些化学药物用于奶牛,一是会影响奶牛的健康,最重要的是这些化合物会在奶里残留,进而影响人的健康。本试验通过牛和鼠在其他组织中的5-HTR1基因序列设计同源性引物采用RT-PCR方法克隆出奶山羊乳腺组织中5-HTR1的基因组全序列,将对下一步针对乳腺中的5-HTR,通过基因敲除技术,提高哺乳动物的产奶量提供理论基础。
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